Биотехнологи привили репу на резуховидку со встроенной в геном системой CRISPR/Cas9
Биотехнологи из Германии отредактировали геном растения, привив его на модифицированный подвой. Ученые создали химерные растения, прививая два вида крестоцветных на генетически отредактированную резуховидку Таля. Подвой выступил в роли вектора для доставки CRISPR/Cas9 в привой и в семена. Согласно эксперименту, несколько десятых долей процента от всех молекул мРНК Cas9, синтезированных в корне такого химерного растения, перемещаются в его побег. Предложенную технологию геномного редактирования можно применять для создания новых линий культурных растений. Статья опубликована в Nature Biotechnology.
Система геномного редактирования CRISPR/Cas занимает все больше места в медицинской и сельскохозяйственной промышленности (мы подробно рассказывали о ней в материале «Запомните эти буквы») — в первую очередь манипуляции касаются животных. Но подобные манипуляции с растениями несколько сложнее, чем с животными и бактериальными клетками. Ведь у растительных клеток есть полисахаридная клеточная стенка, а значит, невозможно доставить генетический материал в клетку с помощью электропорации (об этой ветви методик мы рассказывали в новости). И приходится либо действовать вирусными или бактериальными векторами, либо использовать другие методы геномного редактирования. А это сложно и порой требует много времени — особенно если у растения низкая скорость и эффективность полового размножения. К тому же, далеко не для всех культурных растений известны и легкодоступны соответствующие векторы.
Технология CRISPR/Cas работает быстрее, но для каждой новой генетической линии приходится создавать заново вектор.
Биотехнологи из Института молекулярной физиологии растений Общества Макса Планка под руководством Фридриха Краглера (Friedrich Kragler) предложили способ, как можно сделать вектор для доставки CRISPR/Cas в растение чуть более универсальным. За основу они взяли механизм межклеточного транспорта регуляторных РНК у высших растений.
Известно, что во флоэме находят высокую концентрацию внеклеточных РНК — как матричных, так и регуляторных. Такие РНК снабжены сигналами внеклеточной локализации — тРНК-подобными сигнальными последовательностями (TLS). Крупные молекулы нуклеиновых кислот могут передаваться между клетками через плазмодесмы (по симпласту) или по проводящей системе растений.
Именно этим механизмом и воспользовались ученые. По их задумке, можно создать одну трансгенную линию растений, в чьем геноме закодирована система редактирования генома с сигналом межклеточного транспорта. Если на такое растение привить другое, то РНК системы геномного редактирования дойдут по проводящей системе до растения-привоя и отредактируют ДНК в некоторых клетках. Среди этих клеток окажется и часть гамет. Тогда гибриды, полученные от такого подвоя, будут генетически отредактированными, и при этом в их геноме не будет самой системы CRISPR/Cas.
Ученые решили испытать технологию на популярном модельном объекте физиологии растений — резуховидке Таля (Arabidopsis thaliana). Они создали линию растения, снабженную направляющей РНК, «выключающей» ген нитратредуктазы (NIA1). Фермент нужен растению для усвоения азота — и если ген не функционирует, а растение растет на среде, бедной азотом, то это заметно по его внешнему виду, что упрощает эксперимент. Другая линия, которую создали авторы исследования, делала растения устойчивыми к гербициду глюфосинату.
Последовательности в генах, кодирующих систему CRISPR/Cas9, были фланкированы TLS-сигналами на основе метиониновой тРНК. Ученые выращивали ростки модифицированных растений до возраста 6-7 дней, после чего срезали их по нижнюю половину гипокотиля, и на них прививали недельные растения резуховидки «дикого типа». Спустя 14 дней после операции, в зависимости от использованных типов TLS, от половины до 90 процентов листьев растений приобрели «азотдефицитный» фенотип.
Секвенирование геномов побегов подтвердило, что в них появилась нефункциональная версия гена NIA1. ПЦР с обратной транскрипцией показала, что примерно каждая тысячная копия РНК Cas9 находится в привое — то есть в той части химерного растения, в геноме которой Cas9 не закодирована. Химерные растения зацвели и дали около 11,7 тысяч семян. Когда ученые секвенировали редактированный участок их генома, они обнаружили 61 случай геномного редактирования. Согласно расчетам, примерно каждый тысячный гибрид первого поколения lдолжен быть гомозиготным.
Но резуховидка не имеет хозяйственного значения, и ученые решили переключиться на родственную ей репу (Brassica rapa). Когда они прививали недельные ростки репы на двухнедельные ростки резуховидки, то в привое оказывалась уже примерно каждая 250-я РНК Cas9 (впрочем, неясно, с чем связан такой рост эффективности генетического редактирования в сравнении с первым экспериментом — с возрастом подвоя или с разной чувствительностью привоев разных видов).
По заключению профессора Краглера с коллегами, можно, прививая хозяйственные растения на уже созданные трансгенные модели, создавать относительно большой спектр новых ГМО, работая изначально с небольшим ассортиментом генетических линий. Для плодовитых культурных растений должно быть достаточно полученной частоты успешного геномного редактирования (каждое 250-е или 1000-е растение). Более того, как предположили ученые, могут существовать механизмы, повышающие чувствительность семян к геномному редактированию в сравнении с вегетативными органами растения — ведь CRISPR/Cas9 в семенах была даже активнее, чем в листьях и цветах.
Конечно, далеко не все травянистые растения легко поддаются прививке, но дальнейшая разработка методики может позволить упростить создание новых генетических линий культурных растений. Вся цепочка создания генетической линии, прививки и получения гибридов первого поколения заняла у авторов статьи около 6-7 месяцев. Но если подвой одной генетической линии использовать много раз для прививки нескольких видов растений, то срок создания новой генетической линии сокращается примерно в два раза — вопрос лишь в дизайне генетических конструктов и в эффективности прививки растений.
У растений писан не только горизнтальный перенос транскриптов, но и перенос генов. И такие процессы активно происходят и без участия человека — например, благодаря им пшеница смогла получить устойчивость к грибковым инвазиям. Но бывает и наоборот: ген передается от растения к растительноядному насекомому, лишая растение защиты от вредителя.
Таков результат исследования 671 собачьей неоплазии
Американские биоинформатики и ветеринары исследовали, какие мутации наиболее характерны для злокачественных опухолей у домашних собак. Секвенирование 59 генов у 671 опухолей от собак 96 пород показало, что в основе онкогенеза у людей и собак зачастую лежат одинаковые изменения в одних и тех же участках генов. Благодаря такому сходству данные, полученные при анализе лечения собак, можно будет активнее использовать в рамках доклинических исследований протоколов лечения злокачественных новообразований у человека. Исследование опубликовано в журнале Scientific Reports. Онкологические заболевания относятся к ведущим причинам ненасильственной смерти у домашних и бездомных собак. Большинство из них (за редкими исключениями) не передаются от животного к животному и обусловлены мутациями в протоонкогенах и опухолевых супрессорах. Патогенез некоторых опухолей собак, в частности, ангиосаркомы, меланомы и рака молочной железы, изучен лучше: про эти опухоли известно, что в их основе лежат нарушения работы тех же генов, что при возникновении таких же человеческих опухолей. Но всеобъемлющей базы мутаций в собачьих онкогенах до настоящего времени не существовало: ведь общее количество секвенированных собачьих опухолевых геномов исчисляется несколькими тысячами. Биоинформатики и ветеринары из Университетов Джорджии и Гарварда, возглавляемые профессором Ша Ин Чжао (Shaying Zhao), провели гистологическое исследование и секвенировали часть генома (экзоны 59 протоонкогенов и опухолевых супрессоров) 671 злокачественной опухоли домашних собак, относящихся к 96 разным породам. Самыми распространенными типами опухолей оказались ангиосаркома и саркома мягких тканей (в общей же сложности ученые обнаружили 23 вида злокачественных опухолей). В 59 генах было идентифицировано 543 уникальных соматических мутации (если доля мутантной последовательности кратна 50 или 100 процентов от всей ДНК этого гена в образце, то мутация была получена клеткой еще до образования опухолевого клона. «Некруглые» доли указывают на возникновение мутации уже в рамках соматической эволюции опухолевого клона). Профиль таких мутаций был связан с гистологическим типом опухоли и ее первичным очагом, но не с породой животного. Больше всего были распространены мутации в гене TP53, обнаруженные в 22,5 процента всех опухолей и в 46 процентах сарком. В этом и еще 11 генах исследователи обнаружили 18 локусов, в которых у разных животных независимо друг от друга возникали мутации. Ученые сопоставили эти горячие точки мутагенеза с результатами секвенирования 25 тысяч геномов человеческих опухолей. Восемь из выявленных точек, в генах TP53, PIK3CA, KRAS, NRAS, PTEN и BRAF, совпали у человеческих и собачьих опухолей. Данные, представленные группой профессора Чжао, составляют на сегодняшний день самый большой набор сиквенсов собачьих злокачественных опухолей. По словам авторов, сходство генетических изменений при онкогенезе у собак и людей позволит в будущем проводить доклинические исследования на собаках в рамках процедуры регистрации протоколов лечения человеческих неоплазий. Но до окончательного понимания того, насколько генетически похожи опухоли собак и людей, еще слишком далеко, ведь исследование американских ученых включало в себя только секвенирование малой части опухолевого экзома. Чем больше лекарств для таргетной терапии появляется в арсенале врачей, тем сложнее становится диагностика в онкологии. И пока одни ученые описывают, чем «рак-меццо-форте» отличается от «рака-пиано», другие ищут новые сенсоры для ранней диагностики рака. О том, насколько эффективен собачий нос в качестве такого сенсора, читайте в материале «Запах опухоли».