Клетку проткнули электрическим нанофонтаном
Американские ученые предложили доставлять биологические молекулы внутрь отдельных клеток с помощью нанофонтанного зонда, который протыкает клеточную мембрану генерируемым импульсом и впрыскивает вещество в ее цитозоль. С помощью зонда ученым удалось ввести вглубь клетки меченный флуоресцентным белком бычий сывороточный альбумин, а в будущем технология позволит внедрять внутрь клетки практически любой молекулярный груз — с лечебными или исследовательскими целями. Об этом рассказывается в журнале Small.
Молекулы внутрь клетки можно доставлять самыми разными способами: например, вирусными векторами или при помощи химических носителей — простых пептидов или полимерных нанокапсул. Кроме того, для этого также применяют катионно-липидный реагент липофектамин или метод объемной электропорации. У каждого способа есть свои плюсы, но и ограничения: так, вирусные векторы при всей своей эффективности могут вызывать неблагоприятные иммунные реакции или генотоксичность, а химические носители зачастую оказываются губительными для самой клетки.
Кроме того, эксперименты с доставкой веществ внутрь клеток необходимо проводить на генетически однородных клеточных популяциях. Обычно, чтобы избежать генетически смешанных популяций клеток, требуется вырастить и отобрать отдельные клетки, которые потом будут производить линии идентичных им клонов. Однако сам этот способ отбора клеток чрезвычайно сложен и требует много времени.
Ученые под руководством Горацио Эспиноза (Horacio Espinosa) из Северо-Западного университета придумали, как обойти эти проблемы. Они предложили способ электропорации отдельных клеток с помощью электрического импульса, который генерируется нанофонтанным зондом — стеклянной микропипеткой с размером наконечника менее одного микрометра. Подобные микроэлектроды ранее уже использовались, например, для фиксации локального потенциала на клеточной мембране. Теперь же ее применили для электропорации оболочки эукариотической клетки.
Сперва ученые создали математическую модель взаимодействия зонда с живой поверхностью, чтобы предсказать поведение сформированной электрической цепи. Так они смогли определить оптимальные параметры электрического воздействия на мембрану, и только потом применили их на живых клетках.
Эксперимент с проколом мембраны и последующим транспортом молекул внутрь конкретной клетки проходил в три этапа: сперва производился заряд мембраны, затем электрический импульс с электрода проделывал в ней отверстие и, наконец, содержимое пипетки впрыскивалось в цитозоль клетки. По толщине самой мембраны, разности электрических потенциалов на ней и сопротивления места контакта электрода с поверхностью ученые рассчитывали силу электрического импульса, который требовался для создания поры и впрысквания вещества.
С помощью зонда удалось перенести молекулу бычьего сывороточного альбумина, помеченную флуоресцентным белком, внутрь отдельной первично выращенной клетки, а также в клетку линии HeLa. При этом клетки оставались неповрежденными.
Затем исследователи сравнили эффективность переноса веществ внутрь клеток с помощью нанофонтанного зонда с аналогичным методом трансфекции при помощи плазмид. Они продемонстрировали, что новая система в 95 процентах случаев обеспечивает успешную доставку молекул белков, ДНК и РНК в различные «бессмертные» клеточные линии (такие как клетки HeLa) или в культуру первичных клеток эукариот. При этом только 10 процентов клеток в результате таких манипуляций погибало — это, по словам авторов, не так много. Подобная эффективность и малая инвазивность обеспечивались тонкой настройкой параметров электрического воздействия на живую систему клетки, что значительно снижает вероятность ее гибели.
Новый метод подходит для клеточной терапии и для изучения некоторых заболеваний. В первом случае речь идет о редактировании генома и иммунотерапии, например, для лечение онкологических заболеваний путем перепрограммирования Т-лимфоцитов. Во втором случае — о контроле за протеканием врожденных генетических недугов. Кроме того, зонд позволяет исследовать динамику заживления поры в клетке, после того, как та была подвергнута импульсному воздействию.
Путем сочетания электропорации единственной клетки и покадровой флуоресцентной визуализации исследователям удается фиксировать время, которое необходимо для закрытия временно образовавшихся пор. Это важно для понимания необходимости в повторном электрическом воздействии на мембрану, например, для того, чтобы отобрать из клетки контрольные пробы вещества и при необходимости увеличить объемы доставляемого молекулярного груза.
Наиболее перспективное применение электрического нанофонтанного зонда — доставка факторов плюрипотентности и контроль за их концентрациями при перепрограммировании человеческих стволовых клеток. Кроме того, с помощью него можно строго контролировать дозировку cas-белков в технологии редактирования генома CRISPR/Cas9.
Недавно немецким исследователям удалось адресно доставить внутрь раковых клеток лекарство при помощи наночастиц на основе гликопротеина муцина с присоединенной к нему молекуле ДНК. Об этом можно прочитать тут.
Алексей Козлов
И еще четырех видов опухолей
Британские и датские иммунологи обнаружили на цитотоксических T-лимфоцитах рецептор, узнающий одновременно три разных опухолевых антигена. Пациент, у которого были обнаружены эти Т-клетки, смог достичь полной ремиссии меланомы четвертой клинической стадии. Такое строение T-клеточных рецепторов не дает клеткам опухоли ускользнуть от противоопухолевого иммунитета. Похожие типы Т-клеточных рецепторов есть и у здоровых людей, но их роль в противоопухолевом иммунитете пока неясна. Исследование опубликовано в виде статьи в журнале Cell. Клеточная терапия онкологических заболеваний направлена на введение в организм Т-лимфоцитов, узнающих фрагменты белков опухоли, выставляемые клетками на поверхности белков главного комплекса гистосовместимости (HLA-антигенов). Она позволяет добиться ремиссии во многих случаях, при которых другие виды лечения неэффективны. Но врачи часто сталкиваются с ускользанием опухолевого клона от такого иммунитета. Иногда достаточно нескольких месяцев, чтобы опухолевые клетки перестали экспрессировать маркер, который должны были узнавать лимфоциты. Хотя большинство Т-лимфоцитов узнают один эпитоп, некоторая часть из многообразия Т-клеточных рецепторов, образующихся в процессе созревания Т-клеток, узнает не один, а сразу несколько антигенов. Такие клетки есть и у здоровых людей, и у пациентов с аутоиммунными болезнями. Рецепторы, нацеливающие иммунную систему сразу на несколько молекул-мишеней, могли бы повысить эффективность клеточной терапии. Ведь даже если с поверхности опухоли исчезнет один антиген, то иммунный ответ против второго сохранится, и лечение останется эффективным. Шаг в сторону использования этого принципа в терапии сделала группа онкологов и иммунологов из Великобритании и Дании под руководством Эндрю К. Сьюэлла (Andrew K.Sewell) из Университета Кардиффа. На протяжении последних 15 лет они занимаются клеточной терапией меланомы. В рамках клинических исследований врачи забирали у пациентов клетки крови, отбирали среди них Т-лимфоциты, тропные к меланоме, и после культивации in vitro вводили клетки обратно пациентам. В одном из исследований, проведенном в 2011-2014 годах, участвовал пациент с четвертой клинической стадией меланомы, у которого клеточная терапия позволила добиться десятилетней ремиссии болезни (обычно же медианная продолжительность жизни с момента постановки диагноза у таких пациентов не превышает года). Ученые решили детально исследовать, с какими особенностями Т-клеточного ответа это было связано. Как выяснили иммунологи, почти вся противоопухолевая активность лимфоцитов пациента была связана одним лимфоцитарным клоном (его обозначили MEL8), который реагировал in vitro не только на меланому, но и на клетки острого миелолейкоза, опухоли молочной, предстательной и поджелудочной железы от других пациентов с таким же типом HLA-антигена (гаплотип HLA A*02:01, наиболее распространенный в мире). Это было неожиданно, ведь рецепторы этих Т-клеток чувствительны к белку мелану A, специфичному для меланоцитов и происходящих от них опухолей (включая меланому). Авторы создали библиотеку из 936 миллиардов декапептидных последовательностей и оценили in silico сродство рецепторов MEL8 к олигопептидам, связанным с HLA A*02:01. Такой скрининг позволил отобрать 500 пептидов, представленных в протеоме человека. Три из них — участки белков мелана А, BST2 и IMP2 — имели сродство к Т-клеточному рецептору MEL8 in vitro и при этом экспрессировались меланомой. У всех трех декапептидных последовательностей нашлась гомология и на уровне аминокислотной последовательности, и на уровне третичной структуры, что было подтверждено рентгеноструктурным анализом. Т-клетки, у которых есть рецепторы, тропные одновременно к мелану А, IMP2 и BST2, были обнаружены у здоровых добровольцев и у одного пациента с хроническим лимфолейкозом, но их количество было невелико. Обнаруженный вид поливалентного рецептора можно использовать и для лечения других пациентов: исследователи секвенировали последовательность Т-клеточного рецептора и трансдуцировали этой последовательностью другие линии лимфоцитов в рамках своих экспериментов. Следовательно, есть предпосылки для создания эффективной клеточной терапии опухолей или противоопухолевой вакцины. Впрочем, пока невозможно говорить, насколько безопасной было бы такое лечение, ведь исследование британских и датских ученых основано лишь на единичных наблюдениях пациентов с опухолями. Кроме того, распознавание эпитопов Т-клеточным рецептором зависит от варианта HLA.антигена, имеющегося у данного конкретного человека, и распространенность полимодальных Т-клеточных рецепторов у носителей разных вариантов HLA может отличаться. Даже сильного иммунного ответа против клеток меланомы может оказаться недостаточно для победы над болезнью — на эффективность лечения могут влиять такие факторы, как уровень тестостерона.