Клетку проткнули электрическим нанофонтаном

Horacio Espinosa et al. / Small, 2020
Американские ученые предложили доставлять биологические молекулы внутрь отдельных клеток с помощью нанофонтанного зонда, который протыкает клеточную мембрану генерируемым импульсом и впрыскивает вещество в ее цитозоль. С помощью зонда ученым удалось ввести вглубь клетки меченный флуоресцентным белком бычий сывороточный альбумин, а в будущем технология позволит внедрять внутрь клетки практически любой молекулярный груз — с лечебными или исследовательскими целями. Об этом рассказывается в журнале Small.
Молекулы внутрь клетки можно доставлять самыми разными способами: например, вирусными векторами или при помощи химических носителей — простых пептидов или полимерных нанокапсул. Кроме того, для этого также применяют катионно-липидный реагент липофектамин или метод объемной электропорации. У каждого способа есть свои плюсы, но и ограничения: так, вирусные векторы при всей своей эффективности могут вызывать неблагоприятные иммунные реакции или генотоксичность, а химические носители зачастую оказываются губительными для самой клетки.
Кроме того, эксперименты с доставкой веществ внутрь клеток необходимо проводить на генетически однородных клеточных популяциях. Обычно, чтобы избежать генетически смешанных популяций клеток, требуется вырастить и отобрать отдельные клетки, которые потом будут производить линии идентичных им клонов. Однако сам этот способ отбора клеток чрезвычайно сложен и требует много времени.
Ученые под руководством Горацио Эспиноза (Horacio Espinosa) из Северо-Западного университета придумали, как обойти эти проблемы. Они предложили способ электропорации отдельных клеток с помощью электрического импульса, который генерируется нанофонтанным зондом — стеклянной микропипеткой с размером наконечника менее одного микрометра. Подобные микроэлектроды ранее уже использовались, например, для фиксации локального потенциала на клеточной мембране. Теперь же ее применили для электропорации оболочки эукариотической клетки.
Эксперимент с проколом мембраны и последующим транспортом молекул внутрь конкретной клетки проходил в три этапа: сперва производился заряд мембраны, затем электрический импульс с электрода проделывал в ней отверстие и, наконец, содержимое пипетки впрыскивалось в цитозоль клетки. По толщине самой мембраны, разности электрических потенциалов на ней и сопротивления места контакта электрода с поверхностью ученые рассчитывали силу электрического импульса, который требовался для создания поры и впрысквания вещества.
С помощью зонда удалось перенести молекулу бычьего сывороточного альбумина, помеченную флуоресцентным белком, внутрь отдельной первично выращенной клетки, а также в клетку линии HeLa. При этом клетки оставались неповрежденными.
Затем исследователи сравнили эффективность переноса веществ внутрь клеток с помощью нанофонтанного зонда с аналогичным методом трансфекции при помощи плазмид. Они продемонстрировали, что новая система в 95 процентах случаев обеспечивает успешную доставку молекул белков, ДНК и РНК в различные «бессмертные» клеточные линии (такие как клетки HeLa) или в культуру первичных клеток эукариот. При этом только 10 процентов клеток в результате таких манипуляций погибало — это, по словам авторов, не так много. Подобная эффективность и малая инвазивность обеспечивались тонкой настройкой параметров электрического воздействия на живую систему клетки, что значительно снижает вероятность ее гибели.
Новый метод подходит для клеточной терапии и для изучения некоторых заболеваний. В первом случае речь идет о редактировании генома и иммунотерапии, например, для лечение онкологических заболеваний путем перепрограммирования Т-лимфоцитов. Во втором случае — о контроле за протеканием врожденных генетических недугов. Кроме того, зонд позволяет исследовать динамику заживления поры в клетке, после того, как та была подвергнута импульсному воздействию.
Путем сочетания электропорации единственной клетки и покадровой флуоресцентной визуализации исследователям удается фиксировать время, которое необходимо для закрытия временно образовавшихся пор. Это важно для понимания необходимости в повторном электрическом воздействии на мембрану, например, для того, чтобы отобрать из клетки контрольные пробы вещества и при необходимости увеличить объемы доставляемого молекулярного груза.
Наиболее перспективное применение электрического нанофонтанного зонда — доставка факторов плюрипотентности и контроль за их концентрациями при перепрограммировании человеческих стволовых клеток. Кроме того, с помощью него можно строго контролировать дозировку cas-белков в технологии редактирования генома CRISPR/Cas9.
Недавно немецким исследователям удалось адресно доставить внутрь раковых клеток лекарство при помощи наночастиц на основе гликопротеина муцина с присоединенной к нему молекуле ДНК. Об этом можно прочитать тут.
Алексей Козлов