Транспозоны помогли найти оптимальные участки для разрезания белков
Биологи предложили искать участки для разделения белка на половинки не только с помощью компьютерного моделирования. Таким образом можно обнаружить те участки, которые программа рискует упустить из-за неточностей модели или недостаточной информации о том, какие разрезы критически влияют на структуру белка, лишая его возможности вновь функционировать после соединения частей, а какие – нет. В работе, опубликованной в Nature Communications, авторы при помощи транспозонов нашли новые участки в белковых молекулах, куда можно внести разрез и добавить части интеина – последовательности, которая затем может сшить половинки белка обратно.
Каждая молекула белка появляется на свет в виде длинной цепочки аминокислотных остатков. Затем в ходе фолдинга (сворачивания) белок приобретает свою структуру, при этом у некоторых белков вырезаются участки цепи – интеины. Точнее, интеины вырезают из цепи сами себя и соединяют соседние участки пептидной связью. Этот процесс называется белковым сплайсингом.
Интеин может находиться как и внутри одной полипептидной цепи, так и на концах двух разных цепей в виде половинок. В таком случае половинки соединяются между собой в целый интеин, который также вырезает себя и собирает две полипептидных цепи в один белок. Синтетические биологи видят в этом свойстве интеинов прекрасный инструмент для проведения логических операций на молекулярном уровне. Почти любой белок можно поделить на две части и к их концам «пришить» часть последовательности интеина. Сами по себе такие части не будут нести никаких функций, и только после сплайсинга превращаться в рабочую молекулу. При помощи подобной схемы можно реализовывать логические операции И и И-НЕ, что ученые уже применили для создания ДНК-сенсоров или проведения направленной эволюции с определенными условиями. Но в целом использование интеинов пока сильно ограничено: достаточно трудно определить, где конкретно разделить нужный белок на две части с половинками интеина на концах так, чтобы сплайсинг проходил успешно и функция белка восстанавливалась после него.
Как правило, при создании подобных конструкций ученые опираются на компьютерное моделирование трехмерных структур белков и пытаются предсказать подходящие участки для разрезания белка. Такой подход может быть неоптимальным в синтетической биологии, где исследователи часто используют оригинальные или необычные молекулы, структуры которых еще не получили разъяснения.
Ученые из Эдинбургского университета под руководством Баоцзюня Вана (Baojun Wang) предложили способ относительно быстро вносить и пробовать на практике новые места разделения белков и вставки интеинов. Исследователи использовали транспозоны (мобильные генетические элементы), чтобы случайным образом вставлять в нужную последовательность половинки интеина и метки для начала транскрипции и трансляции для C-части белка. Таким образом, вставка транспозона делила белок на две части, которые могут независимо друг от друга синтезироваться в клетке и соединяться при помощи интеина.
Функциональность системы авторы работы сначала проверили на белке mCherry – молекуле с красной флуоресценцией, для которого уже известны два оптимальных места разрезов. При помощи предложенного ими способа авторы работы обнаружили 15 участков, но при этом один уже известный система не нашла. Похожим способом, но с другим интеином, ученые обнаружили и ранее не задокументированный участок для разреза бета-лактамазы.
Затем исследователи решили испробовать новую систему для создания белковых операторов И и И-НЕ. Для этого ученые решили использовать транскрипционным факторы – белки, которые регулируют транскрипцию ДНК. Если транскрипционный фактор контролирует транскрипцию гена флуоресцентного белка, то функциональность самого фактора можно оценить по уровню флуоресценции. При помощи транспозона с половинками интеина ученые отобрали варианты разделения на части двух транскрипционных факторов. В получившейся системе две части транскрипционного фактора синтезируются только в присутствии соответствующих малых молекул. Таким образом, целый функциональный фактор может собраться только в присутствии обеих молекул – и либо запустить синтез флуоресцентного белка, либо его заблокировать, выступая в роли оператора И или И-НЕ. Для двух из трех испытанных факторов репрессия и активация наблюдались спустя 5 и 24 часа после добавления малых молекул.
Кроме того, ученые предположили, что можно использовать не разделенный на части стандартный интеин, а преобразовать его таким образом, чтобы он удалял себя из белка только в присутствии какой-либо молекулы. Им частично удалось реализовать задумку, однако в большей части исходного белка так и не запустился процесс сплайсинга при добавлении активирующей молекулы, а часть белка наоборот, проходила этот процесс и без молекулы-активатора. Авторы работы надеются, что в будущем удастся полностью управлять работой интеинов.
Разделенные на части белки, которые восстанавливают свою функциональность только после соединения – распространенный в биоинженерии инструмент. Например, ранее биологи использовали разделенный на части белок Cas9 с половинками интеинов на концах для редактирования ДНК в клетках печени мышей.
Вера Сысоева
Изучать на них магниторецепцию не получится
Исследователи из Великобритании и Германии на протяжении шести лет воздействовали суммарно почти на сто тысяч дрозофил магнитным полем и выяснили, что они не меняют свое поведение под действием этого поля и в целом никак на него не реагируют. Это опровергло результаты предыдущих экспериментов, где чувствительность мух к магнитному полю была доказана, — прошлые результаты ученые посчитали ложноположительными. Работа опубликована в Nature. Некоторые животные обладают магниторецепцией — например, перелетные певчие птицы мигрируют в основном по ночам и ориентируются по магнитному полю земли. Точно не ясно, как работает их внутренний компас, но основная гипотеза такая: в сетчатке из глаз есть криптохромы — светочуствительные белки, которые реагируют на магнитное поле, а в мозге — нейроны, которые обрабатывают информацию, поступающую с магниторецепторов сетчатки. Такую же способность ученые обнаружили и у летучих мышей. По некоторым данным, магнитное поле чувствуют и плодовые мушки дрозофилы (Drosophila). Криптохромы из их сетчатки реагировали на магнитное поле в экспериментах in vitro, а в других исследованиях [1, 2, 3] под действием магнитного поля их поведение менялось. Поэтому мух иногда используют как модельный организм, чтобы изучать магниторецепцию: геном дрозофил можно редактировать, и эксперименты над ними ставить проще, чем над птицами. Марко Бассетто (Marco Bassetto) из Ольденбургского университета имени Карла фон Осецкого и его коллеги из Великобритании и Германии решили проверить, на самом ли деле дрозофилы чувствительны к магнитному полю. Они воспроизвели несколько экспериментов на гораздо большей выборке и в более контролируемых условиях. Сначала они запустили мух в Т-образный лабиринт, к одному из рукавов которого было приложено магнитное поле с индукцией около 500 микротесла. Установку разместили в электромагнитно-экранированной камере в деревянном здании — в итоге фоновые радиочастотные поля сильно ослаблялись и не должны были повлиять на эксперимент. Дрозофил тестировали группами по 100 особей; предполагалось, что наивные мухи будут избегать рукава с магнитным полем (как это было в ранних экспериментах), а если научить их ассоциировать поле с наградой в виде сахарозы, то они станут предпочитать этот рукав. Однако ничего из этого не подтвердилось: и наивные, и обученные дрозофилы выбирали оба рукава с одинаковой частотой. А вот в контрольных экспериментах мухам удалось связать награду и запах. Всего ученые провели почти 1000 тестов и протестировали таким образом 97650 мух. Затем они поместили дрозофил в вертикальные пластиковые трубки, помещенные между двойными катушками. К одной из трубок было приложено магнитное поле с индукцией 500 микротесла, а к другой — нет. В таких трубках мухи обычно поднимаются, сопротивляясь земному притяжению, — это называется отрицательным геотаксисом (личинки некоторых насекомых, напротив, стремятся вниз, к земле). В предыдущих исследованиях под действием тусклого синего цвета и магнитного поля мухи поднимались медленнее. Здесь же ученые не обнаружили никакой разницы в скорости подъема мух в зависимости от наличия магнитного поля. Однако, как и в раннем эксперименте, под действием красного цвета дрозофилы поднимались медленнее, чем под действием синего (магнитное поле все еще не влияло). Затем ученые усовершенствовали экспериментальную установку и проверили в ней магнитные поля 0,90, 220 и 300 микротесла. Однако и тогда магнитное поле не влияло на скорость подъема насекомых. В предыдущих исследованиях также сообщалось, что магниточувствительность мух проявляется под действием более коротких волн света. Авторы проверили и это, но и здесь дрозофилы никак не реагировали. Авторы заключили, что дрозофилы, судя по всему, не способны ощущать магнитные поля околоземной силы (ниже 500 микротесла). А статистический анализ показал, что результаты ранних экспериментов были, вероятнее всего, ложноположительными: на это указывают небольшие выборки и низкая статистическая мощность. Таким образом, изучать магниторецепцию лучше на ночных мигрирующих певчих птицах. А ранее исследователи из Канады и США выяснили, что нейроны птиц, реагирующие на магнитное поле, активны только во время миграции. Во время ночного отдыха их активность снижается.