Антисмысловые нуклеотиды вылечили глухоту у мышей внутриутробно

Ученые применили антисмысловые олигонуклеотиды для внутриутробной коррекции мышиной модели синдрома Ушера. В результате удалось восстановить экспрессию белка, ген которого мутирует при этом заболевании, и улучшить развитие волосковых клеток внутреннего уха. У мышей были улучшены слух и координация по сравнению с контрольными животными. Методику потенциально можно использовать для внутриутробного лечения нарушений слуховой и вестибулярной системы человека. Статья опубликована в журнале Nucleic Acids Research.

Синдром Ушера — генетическая болезнь, при которой дети рождаются глухими и постепенно теряют зрение. Это заболевание является причиной половины случаев слепоглухоты, его диагностируют у примерно пяти человек из 100 тысяч. Лечения, которое могло бы предотвратить или замедлить развитие синдрома Ушера, не существует.

Причина одной из форм синдрома Ушера (типа 1c) — точечная мутация в гене гармонина. Этот белок находится в стереоцилиях — выростах волосковых клеток внутреннего уха, которые чувствуют колебания жидкости, вызванные звуками. Мутации в гармонине приводят к тому, что волосковые клетки не могут переводить механический сигнал в электрический и передавать информацию нейронам.

Ученые уже успешно восстанавливали продукцию нормального гармонина с помощью антисмысловой терапии в первые дни после рождения у мышей с аналогичной мутацией. Антисмысловые олигонуклеотиды (АСО) — короткие полимеры, которые связываются с участком РНК по принципу комплементарности и мешают ее созреванию или трансляции. АСО-29 блокирует мутантный участок РНК гармонина. Из-за мутации в РНК появляется дополнительный сайт сплайсинга, и в процессе созревания белки нарезают молекулу неправильно. АСО-29 закрывает неверный сайт сплайсинга от ферментов, и те работают с нужным участком.

Однако в первые дни после рождения слуховая система у мышат еще не сформирована и соответствует степени развития внутреннего уха человека на 18 неделе беременности. Если терапию проводить позже, то она оказывается неэффективной. Значит, если мы хотим применить поход для лечения людей, антисмысловые нуклеотиды нужно вводить внутриутробно, но для начала и такую процедуру нужно отработать на животных.

Линъянь Ван (Lingyan Wang), Бет Кемптон (Beth Kempton) и Хань Цзян (Han Jiang) из Орегонского университета здоровья и науки и их коллеги ввели АСО-29 в амниотическую полость мышей в 13 день беременности. В результате гармонин начал экспрессироваться, сформировались нормальные пучки волосковых клеток, произошло частичное улучшение вестибулярной функции внутреннего уха, однако слух так и не восстановился.

Ученые предположили, что лучший результат можно получить, если вводить АСО непосредственно во внутреннее ухо. На 12,5 день развития эмбриона мыши (соответствует 9 недели беременности у человека) внутреннее ухо представляет собой слуховой пузырек с клетками-предшественниками волосковых и других клеток. В него и сделали микроинъекцию.

На 30 день после рождения авторы провели иммунофлуоресцентное окрашивание улитки внутреннего уха мышей. АСО-29 обнаружили в волосковых клетках на этом сроке. Ряды этих клеток были плотными, в отличие от контроля, и они содержали гармонин. Когда ученые посчитали количество волосковых клеток в улитке, оказалось, что у мышей, которым вводили АСО-29, их значительно больше чем у контрольных животных (p < 0,01; для внутренних волосковых клеток на некоторых расстояниях от верхушки улитки знаительной разницы не было).

На фотографии со сканирующего электронного микроскопа видно, что у мышей, которым вводили АСО-29, практически все волоски клеток улитки организованы в пучки, и большинство этих пучков имеет правильную V- или W-образную форму, тогда как у контрольных животных пучки практически не формируются, а те, что есть, значительно деформированы.

Исследователи оценили работу слуховой и вестибулярной систем у мышат и взрослых животных (220 дней от рождения). Для этого регистрировали возникающую в ответ на звуки различной частоты активность зоны ствола мозга, которая отвечает за слух, и измеряли громкость, при которой в мозге возникало возбуждение — порог слышимости. Затем проверили равновесие в ряде поведенческих тестов.

Порог слышимости для частот от восьми до 32 килогерц у мышей, которым вводили АСО-29, составлял от 50 до 80 децибел и был значительно выше, чем у здоровых (p < 0,01), однако ниже, чем у контрольных животных с мутациями (p < 0,05). Уровень слуха сохранялся и у взрослых мышей. В поведенческих тестах экспериментальные животные проявили координацию, не отличимую от здоровых мышей. Например, они нормально плавали, а в открытом поле не вертелись на одном месте, как контрольные животные, а обследовали территорию у стенок.

С помощью антисмысловой терапии лечат очень разные заболевания: например, у мышей она помогла остановить прионную инфекцию скрейпи и нейродегенерацию. Такое лечение применяют и для людей — например, с помощью персонализированного олигонуклеотида врачи замедлили развитие нейродегенеративного заболевания у шестилетней девочки

Алиса Бахарева