Микрофлюидика помогла смоделировать эмбриональное развитие нервной трубки

Биологи создали систему микрофлюидной подачи градиента вещества в культуру клеток, с помощью которой из стволовых клеток удалось вырастить регионализованную в ростро-каудальном направлении нервную ткань. Клетки разных частей полоски нервной ткани экспрессировали маркеры переднего, заднего или спинного мозга. На 14 день выращивания регионализация культуры соответствовала 8,5-дневному мышиному эмбриону. Модель является простым инструментом для исследования механизмов регионализации при эмбриональном развитии. Статья опубликована в журнале Nature Biotechnology.

В ходе эмбрионального развития клетки однородной нервной трубки дифференцируются в различные отделы нервной системы. На судьбу каждой клетки влияют сигнальные вещества, в окружении которых те находятся. Дифференциацию нервной трубки в ростро-каудальном направлении (от головы к хвосту) обеспечивает градиент Wnt-белков: под его влиянием формируются три первичных отдела (пузыря) головного мозга и спинной мозг. Дальнейшее развитие этих структур определяют локальные градиенты других сигнальных веществ.

Более подробно изучено формирование дорcо-вентральной (спинно-брюшной) асимметрии нервной трубки — здесь путь дифференцировки клеток определят градиент веществ, перпендикулярный ростро-каудальной оси. Его влияние удалось воспроизвести в культуре эмбриональных стволовых клеток человека. Ростро-каудальный же градиент пока удалось искусственно повторить лишь локально: когда на эмбриональные стволовые клетки воздействовали активатором сигнального пути Wnt (ингибитором гликоген-синтазы-киназы-3, иГСК3), они развивались по пути хвостового конца нервной трубки.

Ученые из Дании и Швеции под руководством Агнете Киркебю (Agnete Kirkeby) из Копенгагенского университета попробовали воспроизвести ростро-каудальную дифференциацию целой нервной трубки в культуре. Для поддержания градиента иГСК3 создали систему, которую назвали микрофлюидным регионализатором стволовых клеток (MiSTR). MiSTR состоял из сети микротрубок, в которых смешивались два раствора с разными концентрациями веществ (ноль и два микромоля на литр). Из выходных отверстий в длинную узкую камеру с культурой эмбриональных стволовых клеток человека попадали растворы с последовательно возрастающей концентрацией иГСК3.

В градиенте иГСК3 стволовые клетки дифференцировались в тонкую нервную ткань; к четырнадцатому дню ее толщина составила 100 микрометров. Через разные промежутки времени ткань разделяли на пять отрезков одинаковой ширины для анализа экспрессии генов, отрезкам присвоили буквы A-E (в участке A концентрация иГСК3 была минимальной). Уже в первые сутки в культуре сформировался градиент экспрессии генов: ближе участку A более активным был маркер ростральной части нервной трубки (OTX2), а на противоположном конце — ген каудальной части (GBX2).

К 14 дню выращивания культуры в среднем участке (С) нервной ткани сформировались пики экспрессии нескольких маркеров границы заднего и среднего мозга. В отрезках A и B обнаружили маркеры первичного переднего мозга, только в участке A — гены конечного мозга, а в B — промежуточного (на эти два отдела передний мозг делится в ходе эмбрионального развития). В отрезках D и E экспрессировались гены хвостовой части нервной трубки. Когда величину градиента иГСК3 увеличили с двух до четырех микромолей на литр, граница заднего и среднего мозга переместилась в сегмент B, а передний мозг «сжался» в участок A. Так ученые доказали, что концентрация иГСК3 непосредственно влияет на ростро-каудальную организацию нервной ткани.

Затем ученые оценили разнообразие клеток различных типов в участках выращенной нервной ткани с помощью секвенирования РНК одиночных клеток. В OTX2-положительных (ростральных) клетках экспрессировались маркеры переднего, конечного и промежуточного мозга, а в OTX2-отрицательных — заднего мозга. На границе этих кластеров в клетках обнаружили активность генов, которая отражала формирование среднего мозга и границы заднего и среднего отделов. Полученные данные сравнили с недавним исследованием мышиного эмбриона — локальные паттерны экспрессии генов были схожи с таковыми на 8,5 день развития эмбриона.

Авторы работы отмечают, что градиент концентрации всего одного вещества в модели позволяет имитировать регионализацию нервной трубки, на молекулярном уровне схожую с развитием настоящего эмбриона. А значит, MiSTR можно использовать как простой и доступный инструмент для исследования механизмов рострокаудальной регионализации эмбриона человека.

С помощью микрофлюидики выращивают и целые эмбрионы: например, из стволовых клеток человека удалось вырастить клеточные шарики, которые соответствуют первым стадиям развития зародыша после имплантации. А зародыши мыши уже научились выращивать и из соматических клеток, перепрограммируя их в стволовые.

Алиса Бахарева