Эти буквы должен знать каждый
Почему «нобелевку» за CRISPR/Cas ждали давно
«Матери генетического редактирования» Дженнифер Дудна и Эммануэль Шарпантье получат Нобелевскую премию по химии в 2020 году — спустя всего восемь лет после выхода их статьи о том, что бактериальную систему CRISPR/Cas9 можно использовать для целевого редактирования генома. Несмотря на краткий (для Нобелевского комитета) срок, этой премии мы успели заждаться — то, что после открытия CRISPR/Cas9 жизнь уже не станет прежней, стало ясно давно. Рассказываем, как менялся мир, пока Нобелевский комитет решался присудить Дудне и Шарпантье заслуженную награду — и почему вручил ее именно им.
Разговор о боге
На церемонии объявления нобелевских лауреатов первый вопрос Эммануэль Шарпантье задает китайская журналистка. Она говорит быстро, пытаясь уложиться в отведенные секунды, и голос ее через маску звучит нечетко и глухо. «Многие ученые перед лицом трудностей обращаются к богу за мудрым советом. А вы — сочетаете химию и религию, когда занимаетесь наукой?» Мы не видим лица Шарпантье — на нобелевской пресс-конференции она выступает по телефону — но слышим на другом конце трубки очаровательный смех. «Я не уверена, что поняла вопрос, — отвечает Шарпантье. — Говорю ли я с богом? Нет».
Упреки за вмешательство в божественный промысел достаются ученым регулярно. Так говорили про первых генетиков, а до них селекционеров — еще до того, как в моду вошла евгеника и идея создать «человека улучшенного». О «неестественности» происходящего говорили, когда появились первые генно-модифицированные организмы и техника ЭКО — дети «из пробирок». Два года назад мы назвали «Игрой в бога» материал о том, как Нобелевские лауреаты по химии 2018 года научились получать новые белки с помощью направленной эволюции в пробирке. Нынешние лауреаты поднялись по лестнице в небо еще выше.
Работа Дженнифер Дудны и Эммануэль Шарпантье, от которой начался отсчет новой эпохи в молекулярной биологии (а затем и медицине), вышла в журнале Science в 2012 году. Суть ее, в двух словах, была такой: систему редактирования ДНК, которой пользуются бактерии, чтобы избавляться от вирусов в своем геноме, можно так доработать, чтобы она разрезала вообще любую, на усмотрение исследователей, последовательность в ДНК. Подробно об устройстве CRISPR/Cas мы не раз рассказывали — например, в материале «Запомните эти буквы» за 2016 год, который, что примечательно, заканчивается словами: «Речь, безусловно, идет о том, кому достанется ближайшая нобелевская премия».
Восторги по поводу CRISPR/Cas начались не сразу. «Вау-эффект был после того, как Джордж Черч и Фэн Чжан показали через полгода, что можно делать редактирование в клетках человека, — вспоминает профессор Сколтеха и университета Ратгерса Константин Северинов. — Но их (Дудны и Шарпантье — N + 1) результат, что можно программируемо вводить раскусы в ДНК in vitro, был тем шагом в сторону, который позволил потом делать все остальное.»
За восемь лет, что прошли с момента публикации статьи Дудны и Шарпантье, «все остальное» с CRISPR/Cas9 уже сделали — как самое страшное, так и самое невероятное. С помощью генетического редактирования мы научились удалять, встраивать и переписывать гены, находить коронавирус в капле слюны, перекрашивать «генетическими ножницами» коров, выращивать устойчивые к патогенам картошку и бананы, лечить болезни крови — и даже создали генетически модифицированных детей.
И, как это часто бывает с хорошими открытиями, система CRISPR/Cas поставила перед нами больше вопросов, чем дала ответов.
Чего не может CRISPR/Cas?
Строго говоря, CRISPR/Cas9 не была первой системой генетического редактирования. Вносить направленные изменения в геном молекулярные биологи умели и раньше: сначала — с помощью плазмид и вирусных векторов, которые встраивали нужный ген в ДНК (так были созданы первые ГМО), потом — посредством нуклеаз TALEN и «цинковые пальцы». Но первый метод не позволял работать точно, и зародыши животных с нужными вставками приходилось отбирать из множества неудачных вариантов (что совсем не применимо к людям). Второй метод был куда более точным, но громоздким: для каждого эксперимента «молекулярные ножницы» приходилось конструировать заново.
CRISPR/Cas9 покорила мир своей простотой. «Ножницы», то есть фермент Cas9, во всех случаях одинаковы. Различается только гидовая (направляющая) РНК — нить, комплементарная тому участку ДНК, рядом с которым планируется разрез. Она и служит наводчиком для фермента-ножниц. Таким образом, чтобы поменять мишень, не нужно пересобирать систему — достаточно в пробирке построить короткую РНК нужной последовательности.
«Чтобы, допустим, собрать TALEN, нужно работать три месяца очень плотно, а может и больше, — рассказывает заведующий лабораторией редактирования генома Научного центра имени Кулакова Денис Ребриков, — а CRISPR... сам-то фермент в холодильнике лежит, уже готовый. Направляющую фермент РНК мы делаем за четыре дня. И при этом результат гарантирован. [С TALEN-ом] еще неизвестно, получится за три месяца собрать, или надо будет переделывать. А тут гарантированно».
Простота этого механизма и сделала его многофункциональным. Если разрезать ДНК по двум концам гена, можно удалить его целиком (или какую-то часть). Если подсунуть клетке «заплатку», которую она сможет встроить на это место, можно заменить ген на другой. Если «затупить ножницы», то есть инактивировать Cas9, то можно придать системе и другие функции: например, находить и окрашивать заданные места в ДНК или заменять один нуклеотид на другой, не разрезая цепи (так работают т.н. «редакторы оснований», base editors).
В 2015 году Дженнифер Дудна, как она вспоминает в своей книге «Трещина в мироздании», мечтала о том, как «из неудобочитаемого документа, с трудом поддающегося переводу, геном станет таким же податливым, как фрагмент литературного произведения в руках умелого редактора». Поначалу казалось, что так действительно и произойдет. Но с тех пор стало понятно, что и молекулярный бог не всемогущ.
«Я думаю, что ранний энтузиазм по поводу возможности быстрого применения CRISPR в биомедицине сейчас скорее притушен, — говорит Константин Северинов. — Возникло понимание, что точность неабсолютна, что двухцепочечные раскусы, которые вводили первые CRISPR-ы, могут вызывать большие изменения в геноме, и даже апоптоз („самоубийство“ клеток — N + 1). В этом смысле технологии нового поколения (например, редакторы оснований — N + 1) скорее наоборот пытаются избежать возникновения направленного раскуса, на котором были построены работы Дудны, и показывают скорее, как это обойти».
Но даже в тех случаях, где система CRISPR/Cas9 работает довольно точно, не всегда ясно, как ее применить технически — особенно если речь идет не о лабораторном животном, а о человеке, ради которого — чего не скрывают ни Дудна, ни Шарпантье — вся эта работа и затевалась.
Редактировать отдельные клетки несложно — и это уже пытаются делать, когда речь идет о лечении пациентов с ВИЧ или болезнями крови. Но как быть с целым человеком, в генах которого что-то пошло не так? «Если у вас поражена печень, вам нужно каким-то образом изменить клетки, желательно все, а их там миллиарды или триллионы, — рассуждает Северинов. — Как это сделать — совершенно неясно. Но это не проблема CRISPR, это проблема отсутствия методов эффективной адресной доставки чего бы то ни было в определенные клетки конкретных тканей».
Тем временем, попыток найти решение становится все больше. За восемь лет переписывание ДНК стало рутинной процедурой, инструменты для которой распространились далеко за пределы премиальных лабораторий — есть даже наборы для учебных лабораторных работ. С CRISPR/Cas9 работают по всему миру, от России до Австралии, и даже африканские страны сообщают, что хотели бы редактировать людей, а не ограничиваться животными и растениями. А это порождает уже новую проблему: сможем ли мы вовремя остановиться?
Как резать людей?
До освоения CRISPR/Cas9 генетическая модификация была делом трудоемким, а в отношении людей — и вовсе невозможным. Наследственность представлялась тяжелой ношей, которую мы не в силах ни изменить, ни облегчить и которую, вместе со всеми ее несовершенствами, нам предстоит тащить до конца жизни и переложить на плечи потомков. С появлением «молекулярных ножниц» на горизонте забрезжила надежда на то, что генетические беды с нами не навсегда и что однажды мы сможем выбрать, какие гены нести с собой дальше. Но для этого нужно будет решиться бросить их раз и навсегда — вырезав из зародышевого генома.
Это совершенно новый уровень вопросов, не на все из которых современная генетика готова дать ответ. Так ли много мы знаем вредных мутаций, которые действительно нуждаются в починке, или заведомо полезных генов? На поверку оказывается, например, что генные варианты, которые повышают вероятность болезни Альцгеймера, повышают и фертильность, защитная мутация от ВИЧ влечет за собой риск заболеть гриппом, а гены высокого роста могут сокращать жизнь. И если в случае с животными ученые еще решаются на смелые эксперименты — например, вырезать одним махом десятки ретровирусов из генома свиньи — то как только речь заходит о людях, боязнь «эффекта бабочки» перевешивает, и мало кто оказывается готов рисковать.
Тем не менее, с самого начала было понятно, что готовые на риск ученые найдутся. С самого начала, как только стало ясно, что CRISPR/Cas9 может работать и внутри клеток человека, Дженнифер Дудну начали мучить кошмары. В своей книге она вспоминает, как сравнивала себя с Робертом Оппенгеймером и доктором Франкенштейном, а однажды во сне ей явился сам Гитлер со свиной мордой вместо лица и вопросил: «Я хочу понять, какие применения есть у этой удивительной технологии, которую вы создали».
Кошмар Дудны стал явью в ноябре 2018 года, когда китайский биолог Цзянькуй Хэ рассказал о том, что при его участии появились первые генетически модифицированные дети. И несмотря на то, что мы до сих пор не знаем (и не исключено, что не узнаем никогда), что стало с их геномами и здоровьем, после этого случая стало ясно, что нужно научиться проводить границу между этичным и неэтичным применением CRISPR/Cas.Тем более, что после скандала с Хэ желающие отредактировать эмбрионы человека не исчезли — так, собеседник N + 1 Денис Ребриков вскоре после скандала с Хэ заявил, что ищет семейную пару с наследственной глухотой, готовую родить генетически-модифицированного ребенка, чем вызвал бурный протест сегодняшних лауреатов. Самого Хэ увлечение нобелевским изобретением Дудны и Шарпантье довело до тюрьмы — сидеть в ней китайскому ученому осталось еще два года.
Несмотря на то, что сама Дудна изначально не была категорически против вмешательств в наследуемый геном человека, она вместе с Шарпантье и другими родителями CRISPR/Cas призвала научное сообщество прекратить подобные эксперименты — до тех пор, пока мы не научимся редактировать геном безопасно и не договоримся о том, как это законодательно регулировать. За два года, что прошли с того времени, научное сообщество договорилось лишь об одном: полностью запрещать редактирование никто не собирается. Но чтобы получить на него разрешение, новому Хэ придется долго доказывать, что его технология безопасна, а «генная хирургия» действительно необходима — и значит, споры о редактировании генома эмбрионов продолжатся.
Почему восемь лет это долго?
Многие великие ученые не успевают стать нобелиатами — Нобелевскому комитету не хватает времени оценить последствия их открытий. При том, что иногда между открытием и наградой проходит почти полвека — именно такую историю мы рассказывали пару дней назад, говоря о лауреатах премии по медицине 2020 года: чтобы оценить их вклад в борьбу с гепатитом C, потребовалось, чтобы другие люди научились эту болезнь лечить.
В случае с Дудной и Шарпантье с самого начала было ясно, что процесс пойдет гораздо быстрее. В Википедии есть отдельная страница со списком наград, которые уже получила за свою работу Дженнифер Дудна — с 2012 года их уже 31, не считая Нобелевской премии. «Спустя два-три года [после выхода статьи 2012 года] значение всего этого уже понимали, — вспоминает Денис Ребриков. — Все-таки понадобилось несколько лет, чтобы другие команды повторили и удивились простоте, работоспособности и эффективности. В 2014 году все сказали „вах!“ и пошел вал статей. Можно открыть пабмед, посмотреть график статей с [использованием] CRISPR/Cas: с 14-15 года он идет ракетой вверх, взлетает по экспоненте».
В 2015 году Дудна и Шарпантье уже вошли в прогноз Clarivate Analytics. Как известно, он обычно на несколько лет опережает выбор Нобелевского комитета — и тем не менее, с этого года премии за CRISPR/Cas стали ждать всерьез: с интересом и трепетом.
Интрига здесь состояла не только в том, когда именно Нобелевский комитет «дозреет» — было до последнего момента неясно, кто именно в этом решении будет фигурировать. Как часто, опять же, бывает с великими открытиями, «родителей» у них можно насчитать больше, чем положено по нобелевским правилам.
В своей работе Дудна и Шарпантье только наметили принципы, по которым должны работать «молекулярные ножницы», и опробовали их на бактериях. До реальных побед в мышиных и человеческих клетках их вскоре «докрутили» Джордж Черч и Фэн Чжан, которым не нашлось места в нобелевском списке (их Clarivate Analytics тоже прочил в лауреаты, в 2016-м). Кроме того, параллельно с Дудной и Шарпантье те же самые принципы сформулировала группа литовских исследователей под началом Виргиниюса Шикшниса — со своей статьей они опоздали буквально на несколько недель. Кому из них действительно стоило вручить «материнский капитал» за CRISPR/Cas?
Эти споры шли не только в стенах шведской Академии Наук. Уже несколько лет конфликтуют два клана «родителей» — Калифорнийский университет (в котором работает Дудна), Венский университет и Эммануэль Шарпантье против Института Броуда (который поддерживает интересы Чжана и Черча). Стороны воюют за патент на технологию CRISPR-редактирования генов в клетках эукариот, то есть растений, животных и грибов. Центральная битва, естественно, развернулась в США, но параллельные схватки идут и в других странах. На кону здесь, конечно, не научное признание, а банальная легализация родительских прав в глазах юристов — вместе с которой придут астрономические деньги: CRISPR стал оружием медицины нового поколения, а это, как известно, дело донельзя прибыльное. Европейское патентное бюро заняло сторону Дудны и Шарпантье, в США война продолжается и верх пока одерживает Институт Броуда — в общем, споры о том, кто кому что должен, продолжаются.
Возможно, решение Нобелевского комитета задержали и другие скандалы, связанные с генетическим редактированием. Так, например, Джордж Черч неоднократно говорил о том, что не видит ничего плохого в генетическом «совершенствовании» людей. В США появились стартапы, которые обещали «дизайнерских детей» своим клиентам, а биохакеры начали продавать наборы для «саморедактирования» в домашних условиях. Наконец, после истории с Цзянькуем Хэ многие начали опасаться, что Нобелевской премии за CRISPR/Cas вообще не будет — чтобы не рисковать репутацией Комитета.
Кто следующий?
И тем не менее, не дать эту премию было нельзя. «Про нее уже очень долго говорили, — соглашается Константин Северинов. — Так долго говорили, что уже устали говорить. Что это революционизировало то, как мы работаем, это было понятно сразу. Представьте, что вы ходили с повязкой на глазах, и вот она снялась».
Нобелевский комитет принял соломоново решение (которое, впрочем, тоже предсказывали многие аналитики): премия за открытие, большинство применений которого лежат в вотчине биологии и медицины, присуждена в области химии. Она высвечивает технологию, оставляя в стороне ее завоевания — равно как и споры об их этичности. И это логично, поскольку клинические успехи CRISPR/Cas еще впереди.
«Им дали, как Бараку Обаме за мир — в существенной степени авансом, — размышляет Денис Ребриков, — но это аванс, который, в отличие от Обамы, точно сработает. Очевидно, что технология крутая, она взлетит. Но сейчас она только на старте».
Куда забросит нас этот взлет, сейчас можно только гадать. Несмотря на свои попытки дистанцироваться от этически спорных тем, в своем пресс-релизе Нобелевский комитет дает недвусмысленный прогноз: «эта технология может сделать нашу мечту о спасении от наследственных болезней реальностью». Можно не сомневаться: это не последняя Нобелевская премия за CRISPR/Cas на нашем веку — если только очередной Цзянькуй Хэ снова не испортит генному редактированию репутацию. Следующие CRISPR-лауреаты (эта гонка сейчас только начинается) будут получать свою премию за физиологию или медицину — и им так же просто, как Эммануэль Шарпантье, от вопроса о боге, возможно, будет уже не уйти.
На что похожи и на что способны пять искусственных зародышей человека
Сорок лет назад британские биоэтики постановили: не стоит выращивать человеческие эмбрионы in vitro дольше 14 дней. Эмбриологи тогда спорить не стали — ни у кого и так не получалось продержать зародыш в лаборатории дольше недели. С тех пор техники культивирования изменились, и вот уже целых пять исследовательских групп одновременно подошли к границе 14 дня вплотную. Правда, неясно, нарушили они установившееся правило или нет — и как это правило теперь вообще применять. Двухслойный стандарт Через две недели после оплодотворения человеческий зародыш все еще сложно увидеть невооруженным глазом — он размером в десятую часть миллиметра. Но еще сложнее разглядеть в нем будущего человека. Бóльшую часть бугорка, прикрепившегося к матке, занимают внезародышевые ткани — то есть структуры, которые обеспечивают существование человека внутри матери и не имеют никакого отношения к его жизни после появления на свет. Больше всего места занимает трофобласт — самый внешний из внезародышевых слоев. Рыхлое скопление клеток, которое врастает в стенку матки и образует там «детскую» часть плаценты. Внутри трофобласта — полость хориона, крупный пузырь с жидкостью. Дальше — два пузыря поменьше, амнион (в ходе развития он разрастется в самую крупную из зародышевых оболочек) и желточный мешок (он со временем станет частью кишечника). Между ними зажат, собственно, зародыш — два слоя клеток. В нем еще нет ни органов, ни тканей, ни даже осей тела. Можно распознать только верх и низ (будущие спина и живот): верхний гипобласт помогает строить амнион, нижний эпибласт врастает в желточный мешок. В начале третьей недели развития в эпибласте должно возникнуть углубление — первичная полоска. Она тянется вдоль всего эмбриона и позволяет увидеть, где будут голова и хвост, а также правая и левая стороны. Через углубление первичной полоски клетки мигрируют между слоями, образуя третий слой зародыша (это называют гаструляцией). После этого можно считать, что прообраз человека готов. У него уже есть три оси тела и три слоя, из которых можно это тело собрать. Из верхнего слоя получится кожа и нервная система, из нижнего — кишечник и внутренние органы, а из среднего произойдут мышцы и скелет. Зародыш на этой стадии не может разделиться на двух полноценных близнецов, в лучшем случае получатся сиамские. Исходя из этого и некоторых других соображений, в 1984 году британская Комиссия по исследованию человеческого оплодотворения и эмбриологии предложила останавливать все эксперименты с человеческими зародышами на 14 день развития или на стадии первичной полоски (этому посвящен наш материал «14 дней спустя»). Это правило соблюдается и сейчас: где-то оно вошло в законодательство, где-то осталось на уровне рекомендации от научного сообщества. Правда, в 2021 году ученые признали, что однажды из этого правила придется сделать исключения — чтобы исследовать этапы развития человека, которые невозможно пронаблюдать на реальных эмбрионах. Но до сих пор никто на это не решился. Более того, до недавнего времени никто не мог вырастить даже двухнедельный эмбрион. На шаг ближе Это тем удивительнее, что сам по себе зародыш до гаструляции устроен предельно просто: всего два слоя клеток и никакой, казалось бы, сложной топологии. Причем на мышиных зародышах, у которых ранние стадии развития устроены примерно так же, эмбриологи продвинулись куда дальше — и дорастили их до стадии, на которой появляются предшественники нервной системы и бьется аналог сердца (у человека это происходит к концу третьей недели эмбриогенеза). С людьми оказалось сложнее — по двум причинам. Первая состоит в том, что ученые пытаются обойтись без половых клеток (поскольку, в отличие от сперматозоидов, яйцеклетки добывать довольно сложно, а выращивать искусственные мы пока не умеем). А значит, нужно научиться собирать эмбрионы из стволовых клеток — и проверить, что они развиваются, как настоящие. Такие эмбрионы уже несколько лет как существуют (о них читайте в материале «Здравствуй, гхола!»). Но растить их дольше недели сложно, потому что — и здесь возникает вторая причина неудач — зародыш должен имплантироваться в стенку матки. А искусственную матку до сих пор тоже никто не придумал. То есть нужно каким-то образом имитировать весь набор сигналов, которые эмбрион мог бы получать от матери, — механические, химические и клеточные — или научиться обходиться без них. Теперь сразу пять групп ученых показали, как это могло бы работать. Китайские ученые из группы Ли Тяньцина (Tianqing Li) из Куньминского университета науки и технологий взяли эмбриональные стволовые клетки (это культура клеток из эмбриона на стадии нескольких дней развития), разделили на две группы и обработали первую одними сигнальными веществами, чтобы клетки остались «наивными», а вторую — другими, чтобы клетки превратились в аналог трофобласта. Затем все клетки смешали, и они образовали трехмерные шарики. Ли и коллеги назвали их Е-ассемблоидами (где Е обозначает «эмбрионоподобные»). Сначала ассемблоиды дорастали всего до третьего дня в культуре. Но после того как эмбриологи подобрали условия и стали обрабатывать их по очереди разными сигнальными молекулами, им удалось продержаться уже восемь дней. Причем внутри шариков появились две ключевые полости: амниотическая и желточного мешка. А судя по экспрессии генов, в ассемблоидах образовалось множество типов клеток, необходимых для зародыша перед гаструляцией: не только эпибласт и гипобласт, но еще ткани внезародышевых оболочек и даже что-то похожее на будущие клетки первичной полоски. Правда, трофобласт, самый внешний слой, ассемблоиды так и не отрастили. Ли с коллегами считают, что это даже к лучшему: так ни у кого не возникнет вопросов к этичности эксперимента — сразу видно, что зародыш неполноценный. На всякий случай они остановили культивирование после восьмого дня. Хотя в обсуждении своих результатов задались вопросом: может ли такая структура перейти на следующую стадию развития, еще на шаг ближе к трехслойному человеку? Через ступеньку Строго говоря, ниоткуда не следует, что искусственные зародыши, которые развиваются в искусственных условиях, должны проходить все те же самые стадии, которые ученые привыкли наблюдать у обычных зародышей. Например: к концу первой недели эмбриону человека положено быть полым клеточным шариком со скоплением клеток на одном из сторон. Это стадия бластоцисты, именно в таком виде зародыши обычно приступают к имплантации. Но в эксперименте Ли и его коллег никаких бластоцист не было — в ассемблоидах сразу начали образовываться амнион и желточный мешок. То же самое произошло и в работе, которую опубликовали американские эмбриологи под руководством Берны Созен (Berna Sozen) из Йельского университета. Эта команда не стала собирать зародыш из нескольких частей. Они просто культивировали эмбриональные стволовые клетки в разных средах по очереди: сначала в той, что поддерживает спонтанную дифференцировку клеток, а потом в той, которую используют для работы с постимплантационными зародышами. В итоге сферические кучки стали похожи на то, как выглядит эмбрион на девятый день развития: две полости и двуслойная перемычка между ними. Эту конструкцию Созен с коллегами назвали экстра-эмбриоид (поскольку в нее входят не только собственно зародышевая часть, но и внезародышевые оболочки). Группа Созен продержала экстра-эмбриоиды в культуре всего шесть дней. После этого они разобрали их на отдельные клетки и выяснили, что, судя по набору экспрессирующихся генов, экстра-эмбриоиды ушли гораздо дальше. Например, внутри эпибласта обнаружился градиент экспрессии генов, связанных с передне-задней осью, — то есть появились признаки разметки, характерной уже для гаструляции. А в некоторых клетках нашлись даже маркеры гаструляции (например, гены клеточных контактов, которые позволяют клеткам ползти и выселяться в промежуток между слоями) и первичной полоски. Получается, что внешне экстра-эмбриоиды еще соответствуют ранним стадиям развития, но отдельные клетки в их составе уже готовы к гаструляции или даже ее прошли. Значит ли это, что и этот процесс, как и стадию бластоцисты, в принципе можно проскочить, раз нужные клетки и так появляются сами собой? В 2021 году такие предположения уже звучали: тогда группа эмбриологов заявила, что без стадии первичной полоски млекопитающие теоретически могут обойтись. То есть оси симметрии, разметку тела и третий клеточный слой в любом случае приобрести придется — но процесс их приобретения может начаться на уровне отдельных клеток, без образования той самой структуры, на которую опирается правило 14 дней. А если структуры нет и развитие идет в другом темпе, то как выяснить, прошел ли зародыш критическую стадию? Будем площе Чтобы называться зародышем человека, можно не только не иметь первичной полоски — можно вообще не быть сферой. По крайней мере, так получилось в эксперименте с искусственными эмбрионами, который провела группа Мо Эмбрахимхани (Mo R. Ebrahimkhani) из Питтсбурга. Эти исследователи, как и группа Ли, собрали эмбрион из двух частей: обычных стволовых клеткок (на этот раз индуцированных плюрипотентных, то есть аналогов эмбриональных, полученных из взрослых клеток с помощью репрограммирования) и трансгенных. Встроенный в них ген подталкивал их развитие в сторону внезародышевых тканей. И действительно, за пять дней жизни в культуре над двухслойным диском образовалась амниотическая полость. Но поскольку Эбрахимхани и его команда растили эмбрионы на чашечках, то они распластались по подложке и приняли форму выпуклых дисков. Их так и назвали — дискоиды (в оригинале iDiscoids, где i означает «индуцированные»). Дальше выяснилось, что клеточные слои внутри дискоидов неоднородны и в них заметен градиент экспрессии генов, похожий на зачаток передне-задней оси. А некоторые клетки, судя, опять же, по работе генов, приготовились превратиться в желточный мешок и предшественники кроветворных клеток. Свою статью Эмбрахимхани и коллеги заканчивают абзацем, посвященным этической проблематике эксперимента. Дискоид, заявляют они, это просто удобная модель — она легко воспроизводится и неприхотлива, поэтому на ней можно изучать ранние стадии развития с их сигнальными каскадами и возможными аномалиями. Но никаких шансов на человеческую жизнь у нее нет: ни закрытого желточного мешка, поскольку она распластана на подложке, ни тем более трофобласта. Даже если ее оторвать от культуральной чашки и пересадить в настоящую матку, она не сможет туда имплантироваться — а разве можно тогда говорить о полноценном развитии человека? Модель для сборки Проблему внезародышевых тканей оказалось решить гораздо сложнее, чем проблему сборки искусственных зародышей (с которой каждая исследовательская группа справилась независимо). Двухслойный диск так или иначе вырастает, а вот окружить его нужным количеством вспомогательных пузырей в отсутствие материнской поддержки оказалось практически невозможно. С этим столкнулась и четвертая команда — из лаборатории Магдалены Зерницки-Гетц (Magdalena Zernicka-Goetz), кембриджского эмбриолога, которая одной из первых начала выращивать искусственные эмбрионы in vitro и тем самым угрожать существованию правила 14 дней. Кембриджские исследователи собрали свои зародыши из трех групп клеток: обычных стволовых (им предстояло играть роль эпибласта) и двух трансгенных (они под действием встроенного гена превращались в гипобласт и трофобласт). Получившиеся клеточные шарики перескочили стадию бластоцисты и сразу двинулись дальше, к стадии 8-9 дня развития, образовав амниотическую полость. Как и в предыдущих моделях, в этих эмбриоидах нашлись зародышевые и внезародышевые клетки и не вырос полноценный трофобласт. Зато внутри шариков ученые заметили еще одну важную группу клеток — предшественники половых клеток. Обычно в зародышах они возникают ближе к третьей неделе развития. То есть в тот самый момент, когда эмбрион с точки зрения научного сообщества становится человеком (в такой степени, чтобы эксперименты с ним требовали отдельного разрешения), в нем появляется зачаток следующего поколения людей. Таким образом, в эмбриоидах Зерницки-Гетц и ее коллег возник своеобразный анахронизм: зародышевые ткани развиваются по графику (а то и с опережением), а внезародышевые нет. Кембриджские эмбриологи делают акцент на том, что их эмбриоиды — это модульная конструкция. Зародыши собраны из трех разных типов клеток, причем трансгенных, а это значит, что дальше в эксперименте можно брать линии клеток с разными мутациями или другими трансгенами и проверять, как они влияют на развитие всего эмбриоида. Очень полезная модель — но всего лишь модель, поскольку сама по себе она не способна ни имплантироваться, ни двигаться к следующим стадиям. Ей не хватает внезародышевых частей — а без них собственно человеческие части ни на что не способны. Что такое человек У пятого искусственного эмбриона нет и этой проблемы. Его собрала группа Якоба Ханны (Jacob H. Hanna) из института Вейцмана в Реховоте — та самая группа, которая впервые дорастила зародыш мыши in vitro до стадии образования конечностей. Они начали почти так же, как их кембриджские коллеги, с трех групп клеток-трансгенов. Потом обнаружили, что если хорошо подобрать условия культивирования, то даже обычные, не трансгенные клетки превращаются в эпибласт, гипобласт и трофобласт по отдельности. Из них слепили шарики и оставили расти в трехмерной культуре на качающейся платформе. То, что выросло, назвали SEM — моделью эмбриона из стволовых клеток. SEM-ы тоже проигнорировали стадию бластоцисты и перешли сразу на 9-10 день развития. А потом двинулись дальше. У них появилось все: амнион и желточный мешок, наметки передне-задней оси, предшественники половых клеток, полость хориона, рудиментарный трофобласт и даже зачаточный пуповинный канатик. Ханна и его коллеги сочли, что это соответствует 13-14 дню развития человека, — и свой эксперимент остановили. Но, вероятно, ненадолго. Сами ученые, как и авторы остальных работ, настаивают на том, что просто совершенствуют модель — причем такую, которая подойдет для исследований, «даже если не вполне похожа на настоящий зародыш человека». Но сами при этом замечают, что их SEM-ы структурно очень похожи на то, что можно найти в стенке матки во время беременности. После того, как в сети появились эти препринты об искусственных зародышах, группа кембриджских биоэтиков заявила о том, что пришло время разработать новые правила — и обещала к осени представить проект. Предыдущий набор рекомендаций относится только к настоящим человеческим эмбрионам. Новый регламент должен как-то описывать этические ограничения в отношении лабораторных конструкций, которые сами создатели не решаются назвать человеком, а только приближенной к нему моделью. Правда, чем дальше, тем сложнее сказать, действительно ли мы имеем дело с моделью или уже с реальным человеческим эмбрионом, собранным из отдельных клеток in vitro. Критерии, на которые опирались биоэтики сорок лет назад, постепенно теряют свою актуальность. Нет смысла считать дни, которые зародыш провел в лаборатории, — потому что он начинает не с нуля и перескакивает стадии, развиваясь в собственном темпе. Нельзя проверить, приобрел ли зародыш все нужные свойства, — потому что никто не решится пересадить его в настоящую матку (здесь никаких послаблений в рекомендациях и законах ждать не приходится). Можно, конечно, дожидаться появления первичной полоски — но нет гарантии, что следующий искусственный зародыш не сможет обойтись без нее. Остается только вычислять стадию развития по экспрессии генов и набору клеточных типов — но есть шанс, что и здесь никогда не будет полного совпадения. И придется как-то устанавливать отдельную, молекулярную грань — за которой заканчивается модель человека и начинается настоящий человек. Повод применить новые правила может появиться уже скоро. В последнем предложении своей статьи Ханна и коллеги заявляют, что выяснить, может ли SEM-человек развиваться дальше, «критически важно с точки зрения эксперимента». И нет оснований думать, что они не попробуют это выяснить.