Редактура вглухую

Российский ученый Денис Ребриков, ранее объявивший о планах провести первый после Хэ Цзянькуя эксперимент с рождением устойчивых к ВИЧ «CRISPR-детей», поменял цель — теперь он намеревается избавить потенциальных «отредактированных детей» от наследственной глухоты. Однако этот эксперимент, как сказал N + 1 сам Ребриков, не может начаться, пока он и его коллеги не получат доказательств безопасности своего CRISPR-инструмента, то есть не подтвердят, что он вносит только те изменения в геном, которые необходимы. Именно в отсутствии точности упрекали Хэ в первую очередь — у родившихся отредактированных им девочек оказались не совсем те мутации, то есть CRISPR-система сработала не вполне правильно. Ребриков уверяет, что у него есть технология проверки безопасности, но другие ученые сомневаются, что исключить «промахи» при такой процедуре вообще возможно.

В конце ноября китайский ученый Цзянькуй Хэ объявил о рождении первых в истории генно-модифицированных людей: после его эксперимента родились девочки-близнецы, у которых с помощью CRISPR был изменен ген, отвечающий за восприимчивость к ВИЧ.

Университет, где работал Цзянькуй Хэ, заявил о своей непричастности к этому проекту, коллеги осудили экспериментатора, а власти решили ввести регулирование для подобных экспериментов и, возможно, взяли Хэ под домашний арест.

Разработчики самой технологии CRISPR/Cas призвали ввести глобальный мораторий на генетическое редактирование жизнеспособных человеческих эмбрионов. По их мнению, редактирование клеток пока «недостаточно безопасно и эффективно, чтобы использовать его в клинических целях».

В середине июня проректор Российского национального исследовательского медицинского университета (РНИМУ) имени Пирогова, заведующий лабораторией редактирования генома Научного центра имени Кулакова Денис Ребриков заявил, что собирается повторить эксперимент китайских ученых с рождением CRISPR-детей, обладающих повышенной устойчивостью к ВИЧ.

Ранее научная группа под его руководством провела практически такой же эксперимент с человеческими эмбрионами, с той лишь разницей, что отредактированные яйцеклетки не были подсажены матери. Вместе с тем, сама задача эксперимента — выработать у ребенка устойчивость к ВИЧ за счет искусственной мутации в гене CCR5 — подвергалась критике со стороны научного сообщества, поскольку избежать рождения ВИЧ-инфицированных детей от ВИЧ-инфицированных родителей гораздо проще другими методами.

Смена цели

Ребриков тогда объяснял N + 1, что такой эксперимент имел бы смысл, если бы ребенка хотела родить мать с мультирезистентной формой ВИЧ — при этой форме существующие виды терапии не помогают снизить до безопасного уровня количество вирусов в организме. Она также должна была отказаться от суррогатного материнства, помогающего избежать заражения вирусами. При выполнении этих двух условий создание CRISPR-детей имело бы смысл, говорил ученый.

Теперь Ребриков работает сразу над двумя моделями: вдобавок к эксперименту с ВИЧ он говорит о планах отредактировать эмбрион супружеской пары, в которой оба родителя страдают наследственной глухотой.

«Это моногенное заболевание, наследственная нейросенсорная тугоухость, связанное с мутацией в гене, кодирующем белок коннексин 26 (GJB2). У них одна и та же мутация — делеция одной „буквы“. Я нашел пять супружеских пар глухих, у которых один ребенок уже глухой. Я думал, их мало, а оказалось, что их довольно много», — говорит ученый.

По его словам, он связался с Центром отоларингологии, подведомственным Федеральному медико-биологическому агентству России, где в отделении сурдологии есть большая картотека пациентов. Там он и нашел потенциальных кандидатов. «Интересно, что в России оказался регион с повышенной частотой этого типа глухоты — это Якутия. Там она встречается в пять раз чаще, чем по стране, по миру вообще. Это прямо „клондлайк“ для меня», — говорит он.

Существуют методы реабилитации для страдающих этим типом глухоты с помощью имплантатов, устанавливаемых хирургическим путем. «Но сурдологи говорят, что семьи с обоими родителями с наследственной нейросенсорной тугоухостью часто отказываются от встраивания имплантата. Они объясняют это тем, что операция создаст барьер между ними и ребенком — он перейдет из их мира во внешний мир. Но я думаю, что в ситуации, когда ребенка еще нет, вряд ли какие-то родители сознательно примут решение, чтобы их ребенок стал глухим», — отмечает Ребриков.

В настоящее время уже получено предварительно согласие на «редактуру» от нескольких человек. «В процессе у меня где-то пять пар. Мы сейчас повторно их перегенотипируем, чтобы убедиться в правильности диагноза. Поэтому много сложностей с логистикой, с транспортировкой биоматериала», — добавляет он.

Доказательство безопасности

Ребриков и его коллеги делают CRISPR/Cas-систему, способную убрать делецию одного нуклеотида в гене GJB2, которая и приводит к наследственной глухоте. «Нам нужен примерно месяц, через месяц у нас будет готовая система», — говорит ученый.

Однако главная задача Ребрикова и его группы: доказать, что их CRISPR-система внесет в ДНК те и только те изменения, которые необходимы. Именно появление незапланированных мутаций, обнаруженных у китайских CRISPR-детей, были одной из главных причин резкой критики в адрес экспериментатора.

Ребриков утверждает, что ему удалось разработать метод проверки безопасности, позволяющий свести вероятность нежелательных последствий вмешательства в геном к приемлемому минимальному уровню.

Способ этот, по его словам, состоит в следующем:

• Проверяются общие параметры геноредактирующих систем данного типа (это делает весь мир на очень разных моделях), с тем чтобы определить среднюю целевую и нецелевую активность;
• На основе данного типа геноредактирующих систем создается конкретная система, нацеленная на конкретную мутацию (в геноме человека);
• Эффективность и безопасность системы проверяется на культуре клеток пациента (путем секвенирования их до и после вмешательства);
• Безопасность системы проверяется на эмбрионах человека, на модели с гаметами от доноров с полностью известным геномом (ее эффективность при этом проверить не получится, так как у доноров нет мутации);
• Эффективность и безопасность системы проверяется на эмбрионах конкретных пациентов (будущих родителей) после полного секвернирования их генома, причем не на биопсии трофэктодермы, а на объеме всей бластоцисты (250 клеток);
• Изготавливаются «боевые» эмбрионы, при этом эффективность и безопасность метода проверяется с помощью взятой у них биопсии трофэктодермы (5-7 клеток);
• Лучший эмбрион переносится в матку методом ЭКО.

«У нас есть одна первая диплоидная клетка — зигота, и мы в эту зиготу индуцируем некий ферментативный коктейль — CRISPR/Cas. Он может вносить изменения в ДНК. И наша задача заключается не столько в том, чтобы убедиться, что изменения вносятся там, где надо. Это просто, как правило, это работает. Главное — убедиться в том, что он не вносит изменения там, где не надо. Для этого мы индуцируем, подращиваем этот эмбрион до пяти дней и полностью секвенируем его геном. И биоинформатически сравниваем его с исходником, потому что исходник у нас тоже есть — геномы доноров этих гамет», — объясняет Ребриков.

Кроме того, повторная проверка будет проводиться непосредственно перед подсадкой отредактированного эмбриона женщине: «Мы берем маленький кусочек эмбриона, это пять клеток из 250. Мы анализируем этот кусочек (это называется биопсия трофэктодермы), и если с ним все в порядке, то мы считаем, что и во всех остальных 250 клетках все в порядке».

Конечно, добавляет ученый, существует так называемый «мозаицизм» — не все клетки в эмбрионе могут быть генетически одинаковы. Однако ровно в такой же ситуации женщины оказываются при традиционной процедуре ЭКО. «Сейчас мы делаем предимплантационный генетический скрининг перед ЭКО и встречаем ровно тот же мозаицизм. Но технологию никто не запрещает, это редкие события», — говорит Ребриков.

Однако пока эксперименты по доказательству безопасности не окончены. По словам ученого, ранее начатый эксперимент по проверке безопасности CRISPR-системы для гена CCR5 еще не завершился. «Похвастаться пока нечем», — признает Ребриков.

Он не хочет называть сроки начала и завершения следующего эксперимента — по проверке инструмента для гена глухоты GJB2, но говорит, что при удачном стечении обстоятельств все средства для клинического эксперимента — редактирования эмбриона уже для ЭКО — могут быть готовы через месяц. «Технически, если не сильно забуксуем на регуляторах, то даже через месяц мы могли бы перенести эмбрион. Потом девять месяцев — до рождения ребенка. Но я не знаю, сколько времени займет регуляторика», — говорит он.

«Регуляторика»

По словам Ребрикова, разрешение на будущий эксперимент должны дать как минимум две инстанции: Этический комитет Минздрава РФ и Департамент лекарственного обеспечения и регулирования обращения медицинских изделий Минздрава РФ.

«Этика», как говорит Ребриков, не рассматривает доказательства безопасности самого эксперимента, проверка этой стороны дела лежит на Минздраве. Этический комитет должен проверить обоснованность вмешательства, а с этой точки зрения, по мнению ученого, все в порядке: «в случае с глухотой обоснованность очевидна».

Говоря о доказательствах безопасности, он признает, что стопроцентную гарантию точности редактирования никто дать не может — всегда возможны отклонения, например из-за мозаицизма или появления естественных мутаций.

«У человека может быть какая-то мутация, на которую „набросится“ CRISPR, это предсказать нельзя. Но ровно такая же ситуация — с обычными, применяемыми десятилетиями лекарствами. У человека может быть индивидуальная мутация, создающая, например, непереносимость аспирина. Никто же не запрещает аспирин? Нет, пишут в инструкциях про возможную индивидуальную непереносимость. CRISPR — это такое же лекарство, и у него могут быть трудпрогнозируемые редкие осложнения», — говорит ученый.

Он признает, что широкое обсуждение в СМИ его планов по генетическому редактированию — крайне нетипичная ситуация. Ученые, по его словам, предпочитают публиковать и обсуждать уже полученные результаты, а не планы, которые могут и не сбыться. Однако в «хайпе» есть, по его мнению, и хорошая сторона.

«Мы говорим, что у нас есть все возможности для редактирования генома. Если нам запретят этот эксперимент, то нужно будет объяснять почему, и это создаст ситуацию дискуссии, которая может быть полезна для науки в целом», — говорит Ребриков.

«Сложность чрезвычайно высока»

Реакция российских коллег на заявления Дениса Ребрикова варьируется от вежливых сомнений до прямых требований запретить такие эксперименты.

В частности, по словам заместителя директора Медико-генетического научного центра РАН Вероники Ижевской, этот случай «ясно показывает, что пора выстраивать нормативно-правовую базу, которая бы защищала права людей от бесконтрольного использования генетических технологий».

Ее коллега, завлабораторией функциональной геномики МГНЦ Михаил Скоблов в беседе с N + 1 выразил уверенность, что «в любом институте, где есть нормальные представления о биоэтике, такое не пройдет, никто на это не согласится».

Он сомневается, что оптимизм Ребрикова о возможности доказательства безопасности редактирования генома достаточно обоснован.

«Эта технология может привести к тому, что эмбрион остановится в развитии или ребенок родится с наследственным заболеванием, с опухолевыми заболеваниями, — все это абсолютно реальные риски, которых на сегодняшний день никто не может избежать», — считает Скоблов.

По его мнению, заявления Ребрикова об «уникальном биоинформатическом алгоритме», позволяющем после секвенирования единичных клеток найти все потенциально патогенные аномалии, не выдерживают никакой критики.

«Мы занимаемся исследованием генетических причин наследственных заболеваний, и эффективность диагностики составляет 30-40 процентов. Это значит, что бóльшая часть пациентов остаются без диагноза, потому что генов очень много, мутаций очень много, они могут быть везде и по всякому расположены. И какой бы ни был биоинформатический алгоритм, мы все равно не сможем это сделать даже в 50 процентов случаев», — говорит ученый.

Если бы для поиска потенциально патогенных мутаций надо было проверить 100 мест, объясняет Скоблов, это было бы легко, с этим можно было бы справиться за месяц. Но здесь 3 миллиарда букв.

Ученый подчеркивает, что гарантированно выявить все сбои редактирования невозможно, даже если знать детально, как устроен геном и родителей, и ребенка.

«Сложность анализа генома чрезвычайно высока. Несмотря на то, что у нас есть пациенты, которым делают секвенирование генома, — и папы с мамой, и ребенка, зачастую мы не можем найти ту самую мутацию, приводящую к возникновению заболевания. Мы просматриваем все гены и ничего не находим, хотя казалось бы — вот геном папы, геном мамы, геном больного ребенка. Найти эти события иногда невозможно, они могут быть запрятаны много где, это очень сложный уровень анализа. И это неизбежно приводит к ошибкам», — говорит Скоблов.

Сергей Кузнецов