Расширенный генетический алфавит упростил поиск ДНК-катализаторов

Модификация химического состава ДНК позволяет улучшить ее каталитическую активность, и чтобы упростить поиск ДНК-катализаторов, биоинженеры из США создали набор последовательностей, состоящих из шести видов нуклеотидов вместо обычных для живой природы четырех. Среди сотен триллионов синтезированных ДНК-последовательностей ученые нашли четыре, имеющие сайтспецифическую РНКазную активность. В контрольной группе «обычных» ДНК таких катализаторов не оказалось. Исследование опубликовано в Proceedings of the National Academy of Sciences.

Нуклеиновые кислоты могут обладать каталитической активностью: они способны расщеплять подобные себе молекулы или сами себя. Именно такой механизм лежит в основе концепции «мира РНК». Но катализаторы на основе нуклеиновых кислот — это не только часть биохимической эволюции Земли, но и перспективная основа для биотехнологии будущего.

За последние 30 лет ученые создали нуклеиновые кислоты с активностями полимераз, лигаз и нуклеаз. Но на пути технологии стоит серьезная проблема: каталитическая активность — большая редкость в мире РНК и ДНК. Если взять случайную последовательность РНК длиной в несколько десятков нуклеотидов, то вероятность того, что она будет обладать нужными нам каталитическими свойствами, составляет порядка 10^-30.

Один из способов усовершенствования РНК и ДНК — введение неканонических азотистых оснований. Эксперименты показывают, что с их помощью можно «расширить» генетический код организмов и даже подменять функции белков (мы рассказывали об РНК-катализе образования пептидной связи без рибосом). Но целенаправленный синтез нового полинуклеотида под каждую новую задачу — это гораздо сложнее, чем поиск и селекция среди массива готовых соединений.

Биотехнологи из Фонда прикладной молекулярной эволюции в США во главе с Элайзой Блонди (Elisa Blondi) предположили, что добавление неканонических нуклеотидов должно изменить активность ДНК-катализаторов (дезоксирибозимов) и упростить их селекцию. Для тестирования своей гипотезы они решили найти в наборе последовательностей ДНК молекулы с сайтспецифичной РНКазной активностью.

Они создали библиотеку ДНК на базе шести азотистых оснований. К обычным для ДНК аденина, гуанина, цитозина и тимина ученые добавили два неканонических азотистых основания, 6-амино-5-нитропиридин-2-он и 7-аминоимидазопиримидин-5-он, обозначаемые Z и P. Стерически эти соединения похожи, соответственно, на «обычные» пиримидиновое и пуриновое азотистые основания и комплементарны друг другу. Исследователи создали модифицированную ДНК-полимеразу, копирующую Z- и P-нуклеотиды по принципу комплементарности (о предыдущих экспериментах этой авторской группы мы рассказывали).

Для первичного эксперимента исследователи взяли по 0,5 наномоль каждой из библиотек (около четверти квадриллиона молекул ДНК). По расчетам, в таком количестве материала было представлено около 25 процентов от всех теоретически возможных последовательностей контрольной группы (4²⁵ вариантов). Основная же группа и вовсе должна быть представлена на 0,0011 процента (6²⁵ вариантов).

Чтобы найти эндонуклеазы в библиотеке ДНК, авторы производили селекцию in vitro. В ее ходе создавалась одноцепочечная гибридная молекула ДНК/РНК. Она состояла из «консервативной» и «вариабельной» последовательностей. Консервативная содержала ДНК-праймер с магнитной меткой и РНК-мишень, на которую «нацеливали» нуклеазы. Вариабельный ДНК-участок длиной 25 нуклеотидов, и содержал последовательность-«кандидат» в эндонуклеазы.

В экспериментальной библиотеке уже спустя девять циклов селекции in vitro удалось отобрать четыре последовательности с подтвержденной РНКазной активностью, хотя в контрольной библиотеке их не было и спустя 16 циклов.

Во всех выявленных РНКазах было минимум по два неканонических пиримидиновых нуклеотида. Часть молекул была обнаружена только после четвертого цикла селекции. Следовательно, их либо было очень мало в исходной реакционной смеси, либо они появились в процессе эволюции ДНК in vitro (доктор Блонди с коллегами не делают однозначного вывода об их происхождении).

Исследование самого активного ДНК-катализатора показало, что катализ протекает по пушпульному механизму и требует наличия двух неканонических оснований. При диапазоне pH 7-8 одно из этих оснований было в протонированной форме, а другое — в депротонированной. Во всех случаях гидролиз проходил сайт-специфично благодаря вторичной структуре молекулы. Скорость расщепления субстрата в первые минуты инкубации самого активного ДНК-рибозима достигала 15 процентов в минуту.

По оценке авторов, добавление одной неканонической пары азотистых оснований повышает эффективность селекции РНКаз in vitro как минимум на порядок.

Возможно, ученые наблюдали сочетание эволюции и селекции in vitro (ведь неясно, как появились минорные ДНК-катализаторы), но точно можно говорить о том, что разнообразие «генетического языка» ДНК делает молекулы более многофункциональными. В дальнейшем использование таких ДНК-библиотек позволит быстро создавать новые дезоксирибозимы под конкретный субстрат (достаточно только поменять РНК-мишень).

Эволюция на уровне отдельных молекул за последние годы превратилась в способ синтеза высокоспецифичных катализаторов, рецепторов или лигандов.