Биологи научились быстро пересобирать белковые биосенсоры под нужный патоген
Биологи создали класс белковых биосенсоров, которые светятся в присутствии заданного патогена или маркера заболевания. По словам исследователей, модульность системы позволяет достаточно быстро создавать биосенсоры на новые молекулы-мишени: для этого достаточно провести компьютерный анализ и заменить один из доменов белка. Авторы опубликованной в Nature работы опробовали описанный ими сенсор на ботулотоксине, коронавирусе, маркере инфаркта миокарда и других клинически значимых мишенях.
Биосенсоры на основе белков играют важную роль в синтетической биологии. В фундаментальных исследованиях белковые сенсоры используют для изучения процессов, протекающих в клетках, а в медицине с их помощью, например, надеются предсказывать эффективность терапии для пациентов с онкологическими заболеваниями. Подобные сенсоры создаются на основе существующих в природе белков. Для этого подбирается белковый домен, который может связываться с целевой молекулой-мишенью, и соединяется с репортерным доменом, который выдает читаемый сигнал. Главный недостаток такого подхода — трудозатратность, потому что требуется много биоинженерных преобразований, чтобы получить эффективный биосенсор из этих двух доменов. Поэтому исследователи ищут универсальную платформу, на основе которой можно будет легко создавать биосенсоры на белковые молекулы различных патогенов или маркеров заболеваний, просто заменяя в нем необходимые «детали». Рациональный компьютерный дизайн белков, который активно развивается в последние годы, позволяет создавать белки с необходимыми характеристиками de novo.
В качестве биосенсора может служить белковая система, обладающая двумя почти равными энергетическими состояниями. И присутствие молекулы-мишени должно регулировать, будет ли протекать реакция в сторону видимого ответа, например свечения или смены цвета.
Ученые выделяют три требования к потенциальной сенсорной системе: изменение в системе должно приводить к видимому результату; изменение в системе, которое приводит к видимому результату, не должно зависеть от молекулы-мишени, чтобы систему в целом можно было использовать для детекции разных веществ; и, наконец, система должна легко поддаваться настройке, чтобы можно было детектировать вещества с разными энергетическими характеристиками связывания с сенсором, и чтобы можно было регулировать минимальную детектируемую концентрацию.
Исследователи из Вашингтонского университета под руководством Дэвида Бэйкера (David Baker) создали белковую систему, которая удовлетворяет этим требованиям. Компоненты системы биологи назвали достаточно просто: клетка и ключ. Обе части содержат по кусочку люциферазы, и только когда ключ присоединяется к клетке, люцифераза становится целой и запускает реакцию свечения. В составе клетки два домена: сама клетка и соединенная с ней защелка. Защелка прикрывает собой то место, куда должен присоединиться ключ. В присутствии молекулы-мишени защелка связывается с ней, освобождая место для ключа, и издаваемое свечение говорит о том, что реакция прошла успешно.
Система устроена таким образом, что энергии связывания ключа с клеткой недостаточно, чтобы превзойти энергетические затраты открытия клетки в отсутствии мишени. Но в присутствии мишени дополнительная энергия связывания мишени с защелкой заставляет защелку открыться и приводит к свечению. Поскольку ключ и клетка всегда одни и те же, систему можно перестраивать под разные мишени, просто меняя связывающий ее домен в защелке. Функционирование системы зависит от термодинамического равновесия, поэтому задавая необходимые энергии связывания в системе, можно регулировать минимально детектируемые концентрации веществ.
Работоспособность системы проверили на ботулотоксине — ядовитом веществе, нейротоксине, который вырабатывается анаэробными бактериями и часто становится причиной серьезных отравлений консервами. Попадание ботулотоксина в организм с пищей вызывает сильные нарушения в работе нервной системы и паралич скелетных мышц. Моментальное определение причины отравления помогло бы быстрее оказать необходимую помощь, а превентивное тестирование пищи – предотвратить подобные случаи. Исследователи показали, что ответ на присутствие ботулотоксина Б виден уже через несколько минут. Схожим способом авторы работы определили наличие в растворе белка HER2, повышенная экспрессия которого у человека указывает на развитие определенных типов рака молочной железы, и маркера инфаркта миокарда.
Ученые не прошли мимо и пандемии коронавируса: они показали возможность детекции антител к ковиду и белка-«шипа» (spike protein) вируса, который он использует для проникновения в клетку. Также удалось обнаружить и присутствие вируса гепатита Б и антител к нему.
Авторы работы отмечают, что их разработка должна быть удобна в клиническом применении: вся реакция проходит в одной пробирке, результат виден практически мгновенно, и его можно точно оценить с помощью простой камеры мобильного телефона. De novo созданные белки хорошо нарабатываются клетками, поэтому проблем с массовым производством биосенсоров возникнуть не должно.
Ученые охотно ищут применение новейших биотехнологий для детекции заболеваний. Например, системы на основе технологии CRISPR-Cas: система SHERLOCK точно обнаруживает даже небольшие мутации, а еще один сенсор ищет коронавирус, также выдавая ответ, который можно считать при помощи камеры смартфона.
Вера Сысоева
Он повышает синтез высокомолекулярной гиалуроновой кислоты
Американские и российские исследователи обнаружили, что трансгенные мыши с повышенной экспрессией гена синтазы гиалуроновой кислоты от голых землекопов меньше подвержены спонтанному и индуцированному раку, дольше живут и дольше сохраняют здоровье. Кроме того, у таких животных значительно снижен уровень воспаления в различных тканях. Отчет о работе опубликован в журнале Nature. Голые землекопы (Heterocephalus glaber) выделяются среди грызунов крайне высокой продолжительностью жизни (в неволе — более 40 лет). Кроме того, у них слабее работают рецепторы внутреннего уха и механизмы торможения в нервной системе, зато замедлено клеточное старение и короче иммунная память (из-за чего у них больше наивных лимфоцитов для реакции на новые инфекции). Одно из главных отличий голых землекопов от других млекопитающих состоит в том, что они практически не болеют раком. Как было показано ранее, это связано с высоким содержанием в их тканях высокомолекулярной гиалуроновой кислоты. Этот гликозаминогликан составляет основу внеклеточного матрикса, участвует в пролиферации и миграции клеток, а также влияет на прогрессирование опухолей, причем его свойства зависят от молекулярной массы — высокомолекулярный обладает защитными свойствами, низкомолекулярный — наоборот. Голые землекопы продуцируют гиалуроновую кислоту с крайне высокой молекулярной массой (более 6,1 мегадальтона), которая оказывает мощную цитопротекцию. Чтобы проверить, производит ли она схожий эффект у других видов животных, сотрудники Университета Рочестера, Гарвардской медицинской школы, Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе и Московского государственного университета под руководством Андрея Селуанова (Andrei Seluanov) и Веры Горбуновой (Vera Gorbunova) создали трансгенных мышей с управляемой повышенной экспрессией гена синтазы 2 гиалуроновой кислоты голого землекопа (nmrHas2). У самок и самцов таких животных наблюдалось повышенное содержание высокомолекулярной гиалуроновой кислоты в мышцах, сердце, почках и тонкой кишке; низкое — в печени и селезенке, утилизирующих ее. Тем не менее оно было ниже, чем у голых землекопов, что, вероятно, связано с более высокой активностью гиалуронидазы у мышей. Наблюдения в когортах из 80–90 животных показало, что экспрессирующие трансген nmrHas2 мыши умирают от спонтанного рака реже, чем обычные (57 против 70 процентов). Эта разница была еще заметнее у пожилых (старше 27 месяцев) животных — 49 против 83 процентов. В эксперименте по химической индукции кожного канцерогенеза нанесением 7,12-диметилбензантраценом (DMBA) и форбол-12-миристат-13-ацетатом (TPA) число папиллом на 21-й неделе от него у трансгенных мышей было почти вдвое меньше, чем у обычных. От пола животных подверженность раку не зависела. Масса тела животных из обеих групп в течение жизни не различалась. При этом экспрессирующие nmrHas2 мыши жили дольше, чем обычные — медианная продолжительность жизни у них была на 4,4 процента, а максимальная — на 12,2 процента больше. У животных женского пола сильнее различалась медианная продолжительность жизни (на девять процентов), а мужского — максимальная (на 16 процентов). Оценка эпигенетического возраста по паттернам метилирования ДНК в печени в возрасте 24 месяцев показала, что у трансгенных мышей он примерно на 0,2 года меньше хронологического. Животные из основной группы жили не только дольше жили, но и дольше оставались здоровыми. У них медленнее, чем в контрольной группе, возрастал интегральный индекс немощности (frailty index), который рассчитывается по 31 физиологическому показателю, и они в пожилом возрасте сохраняли подвижность и координацию движений в тесте на ротароде. Кроме того, у трансгенных самок замедлялось развитие остеопороза. Анализ транскриптомов различных органов и тканей экспрессирующих nmrHas2 пожилых мышей выявил особенности, присущие молодым животным, и пониженный уровень воспаления, связанного с возрастом. Молекулярные исследования показали, что высокомолекулярная гиалуроновая кислота производит противовоспалительные и иммунорегулирующие эффекты, а также предохраняет клетки от окислительного стресса. Кроме того, она стимулирует барьерную функцию кишечного эпителия, сохраняет стволовые клетки кишечника и поддерживает оптимальный состав кишечной микробиоты, что дополнительно способствует снижению возрастного воспаления. Таким образом, высокомолекулярная гиалуроновая кислота, произведенная трансгеном nmrHas2, продлила жизнь мышей и сохранила их здоровье в пожилом возрасте, подавляя возрастные воспалительные реакции. Это значит, что эволюционные адаптации долгоживущих животных, таких как голый землекоп, можно искусственно воспроизвести у других видов — возможно, и у человека — с пользой для их здоровья. Также полученные результаты указывают на потенциал клинического применения высокомолекулярной гиалуроновой кислоты для лечения возрастных воспалительных заболеваний кишечника и других органов, заключают авторы работы. В 2016 году исследователи из Великобритании, Германии и ЮАР выяснили, что низкая болевая чувствительность голых землекопов связана с мутацией гена одного из рецепторов воспринимающих боль нейронов. Годом позже американские, немецкие, британские и южноафриканские ученые показали, что эти животные могут долго обходиться без кислорода — в эксперименте они выжили 18 минут в атмосфере чистого азота, после чего восстановили аэробный метаболизм.