Модифицированные бактерии превратили пластиковые бутылки в ванилин

Биохимики из Шотландии с помощью сконструированного штамма кишечной палочки Escherichia coli превратили терефталевую кислоту, полученную из ПЭТ-бутылок, в ванилин. Работа опубликована в журнале Green Chemistry. Обычно переработанное сырье идет на изготовление новых пластиковых бутылок, ученые же предложили метод апсайклинга для получения важного вещества для пищевой (и не только) промышленности.

Одна пятая мирового пластика приходится на полиэтилентерефталат (ПЭТ), из которого изготавливают текстиль и упаковку, преимущественно бутылки для воды и газированных напитков. Поэтому исследователи ищут способы утилизации ПЭТ без ущерба для окружающей среды.

В 2016 году японские микробиологи, исследуя почву вблизи завода по производству полиэтилентерефталата, выделили штамм бактерий Ideonella sakaiensis 201-F6, способный гидролизовать ПЭТ. С помощью специальных ферментов микроорганизм расщепляет полиэтилентерефталат на его мономеры — терефталевую кислоту и этиленгликоль. Эти бактерии способны переработать тонкую (0,2 миллиметра) полимерную пленку за шесть недель при температуре 30 градусов по Цельсию. 

А в прошлом году французским ученым из Университета Тулузы удалось синтезировать усовершенствованную гидролазу, которая работала эффективнее фермента из Ideonella sakaiensis: она смогла расщепить до 90 процентов ПЭТ на мономеры за 10 часов. Этим ферментом была и кутиназа LCC, полученная из листового компоста листьев. Ученые обнаружили, что LCC в 33 раза эффективнее прочих ферментов гидролизует ПЭТ с образованием терефталевой кислоты. Далее исследователи попытались дополнительно улучшить ферментативную активность и термостабильность LCC с помощью белковой инженерии. В итоге специалисты остановились на версии ПЭТ-гидролазы, которая расщепляет 99,8 процента ПЭТ на мономеры.

Теперь биохимики Джоанна Сэдлер (Joanna C. Sadler) и Стивен Уоллес (Stephen Wallace) из Эдинбургского университета, используя улучшенную французскими учеными кутиназу LCC для получения терефталевой кислоты из ПЭТ, решили пойти дальше. Шотландские исследователи при помощи модифицированной кишечной палочки превратили терефталевую кислоту в ванилин.

Ванилин широко используется в пищевой и косметической промышленности, а также в синтезе лекарственных препаратов, гербицидов и чистящих средств. Мировой спрос на ванилин составил около 37000 тонн в 2018 году, а к концу 2025 года — превысит 59000 тонн. 

Исследователи выбрали штамм E.coli MG1655 RARE, который ранее уже использовался для биосинтеза ванилина из глюкозы. Биохимики трансформировали бактерии гибридными плазмидами, которые содержали гены, кодирующие пять ферментов. Эти ферменты катализировали превращение терефталевой кислоты в ванилин через образование промежуточных продуктов: 3,4-дигидрокскибензойной кислоты, 3,4-дигидрокскибензальдегида и ванилиновой кислоты.

Чтобы повысить выход ванилина, ученые оптимизировали условия реакций за счет различных добавок и выбора подходящей кислотности среды. При значении pH от 6 до 8 снижалось количественное превращение терефталевой кислоты в промежуточный продукт — 3,4-дигидрокскибензойную кислоту. А при pH 5,5 наблюдалась максимальная диффузия терефталевой кислоты в бактериальную клетку при минимальном стрессе клетки, вызванным кислой средой.

Далее исследователи продемонстрировали работу метода на использованных пластиковых бутылках. Для начала биохимики с помощью фермента LCC превратили ПЭТ в терефталевую кислоту (при 72 градусах по Цельсию). Затем реакционную смесь охладили до комнатной температуры и добавили к ней модифицированные E. coli. Количество конечного продукта оценивали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. После 24 часов ферментативных реакций был получен ванилин с выходом 79 процентов.

Вопрос о переработке пластика сейчас очень актуален: этот продукт человеческой деятельности загрязняет все новые места. Микропластик обнаруживают не только в почве и водоемах, а даже в воздухе, соли, человеческих экскрементах, комарах. Частицы пластика нашли и в кишечнике антарктических беспозвоночных — то есть пластиковые отходы закрепились даже в пищевых цепях хрупких экосистем Антарктики.

Виктория Барановская