Против ретро

«Каждый раз, когда наступает день рождения, вы понимаете, что лучше выглядеть снова не стали», — так Андрей Гудков, известный исследователь старения, профессор Института исследования рака Розуэлла Парка начал доклад на конференции в Казани. А к концу доклада предложил свой способ профилактики старения. По мнению Гудкова, у СПИДа, старения и опухолей есть общая причина — виноват один и тот же тип белков. Значит, чтобы предотвратить старение и опухоли, можно попробовать принимать препараты от ВИЧ — правда, после того, как их немного доработают.

Тогда, в 2017 году, эта идея выглядела необычно на фоне классических советов геронтологов меньше есть и больше заниматься спортом. Но с тех пор сразу несколько научных групп взялись ее проверять. А сейчас в журнале Nature появилась статья, авторы которой подошли к вопросу фундаментально: вместо того, чтобы совершенствовать старые лекарства, они решили подобрать новое. А чтобы оно работало лучше прежних, ученые взялись максимально точно реконструировать структуру белка, в который оно должно попасть — и который никому до сих пор не удавалось воссоздать в деталях.

Бешеный ксерокс

К своей идее Гудков подводил аудиторию издалека. Он начал с того, что в старении человека, среди прочего, виноваты мобильные генетические элементы. В частности, ретротранспозоны — одни из немногих мобильных элементов, которые могут прыгать по человеческому геному. И в первую очередь, ретротранспозоны LINE-1 (L1) — потому что они единственные, кто могут копировать сами себя, и со временем размножаются и накапливаются в клетке.

Вот как это происходит. Сначала клетка сама считывает информацию с ретротранспозона — строит матричную РНК на основе его ДНК. Потом эта мРНК вместе с другими клеточными мРНК попадает в цитоплазму, где рибосомы строят по ее шаблону белки. Ретротранспозон кодирует два белка: ORF1p и ORF2p. Первый играет, скорее, вспомогательную роль — связывает и стабилизирует собственную мРНК. А вот ORF2p нужен для размножения. Он отправляется вместе со своей мРНК в ядро, строит на ее основе ДНК-копию, — это называют обратной транскрипцией — а затем встраивает эту копию в новое место генома.

L1 встречаются у всех позвоночных, но только в геномах млекопитающих они размножились по-настоящему. У когтистой шпорцевой лягушки и рыбки данио-рерио L1 занимают около 0,5 процента всей клеточной ДНК, а у человека и мыши — уже целых 20 процентов. Поначалу такой разгул ретротранспозонов, вероятно, был млекопитающим на пользу: встраивая свои копии в случайные точки генома половых клеток, L1 могли послужить источником генетического разнообразия в последующих поколениях — и некоторые варианты среди этого разнообразия, по-видимому, оказались удачными. Похожий механизм до сих пор встречается, например, в человеческом мозге. L1 особенно активно размножаются в предшественниках нейронов — и, возможно, тоже создают там разнообразие.

Но это, скорее, исключение. Обычно человеческие клетки все-таки стараются держать свои ретротранспозоны под контролем, чтобы те не встроились в неподходящий участок ДНК и не сломали какой-нибудь жизненно важный ген. Поэтому клетки метилируют нуклеотиды в составе L1, из-за чего эти области генома сворачиваются в гетерохроматин и не участвуют в считывании информации.

По мере старения геном в клетках перестраивается — одни участки ДНК получают дополнительные метильные группы, другие теряют старые. Гетерохроматин постепенно разворачивается — и L1 выходят на свободу. Они копируют себя и пытаются встроиться в новые места. Если встраивание проходит успешно, они могут нарушить работу какого-нибудь гена или регуляторного элемента, а если нет — в ДНК появляются разрывы. К тому же, на размножающиеся генетические элементы реагируют внутриклеточные сенсоры, которые принимают их за вирусы, — и клетки подают иммунной системе сигналы, запускающие воспаление. А воспаление — это всегда химический стресс для окружающих клеток, и значит, новые мутации и новые поломки.

Сложно сказать однозначно, что здесь причина, а что следствие: старение клетки или прыжки ретротранспозонов. С одной стороны, L1 начинают размножаться не сразу, а только после того, как в клетке началась перестройка хроматина. С другой стороны, прыжки L1 вызывают в клетке стресс, а тот уже ускоряет старение. Но геронтологи так или иначе согласны с тем, что между этими процессами есть тесная связь.

К тому же, иногда достаточно и одного прыжка L1, чтобы что-нибудь сломать даже внутри молодого организма. Ретротранспозоны могут стать причиной врожденных болезней и пороков развития — если прыжок случился в половой клетке или зиготе. А если в соматической — клетка может превратиться в опухолевую. В частности, L1 связывают с опухолями печени и поджелудочной железы, а еще колоректальным раком. И они же, видимо, могут приводить к аутоиммунным патологиям — если клетка слишком остро реагирует на их размножение.

В таком случае появлению опухолей — а также некоторых аутоиммунных патологий и других болезней, сопровождающих старение, — можно помешать, если заблокировать молекулярную машину, которая отвечает за прыжки ретротранспозонов. Поскольку L1 кодирует всего два белка, и первый из них — вспомогательный, то мишенью должен стать ORF2p, который обеспечивает копирование. С такого типа белками биологи уже хорошо знакомы — обратные транскриптазы, или ревертазы, которые строят ДНК на основе РНК, есть у любых ретровирусов. В том числе у ВИЧ. Для его ревертазы давно придуманы блокаторы — именно они позволяют множеству носителей этого вируса держать инфекцию под контролем. Исходя из этих соображений и биологи, которые занимаются опухолями, и Гудков, а вслед за ним и другие исследователи старения, предположили, что лекарства от ВИЧ могут помочь и против L1.

Невидимая мишень

Когда пожилых мышей накормили препаратами от ВИЧ, у них действительно стали слабее проявляться признаки воспаления и возрастных патологий, вроде мышечной атрофии и повреждения почечных сосудов. Но на людях таких экспериментов никто пока не ставил — потому что проверку лекарств против старения организовать очень непросто (мы писали об этом в материале «Дело не в морщинах»). Только недавно начались пилотные испытания препаратов от ВИЧ при болезни Альцгеймера (как одной из возрастных патологий).

Были и испытания против конкретных опухолей — большинство из них еще не добрались до третьей фазы, а во второй пока далеко не у всех пациентов врачи заметили эффект от лечения. Но это не обязательно означает, что идея остановить ретротранспозоны неправильная.

Может, конечно, оказаться, что наблюдаемой связи недостаточно и L1 на самом деле вносят не такой большой вклад в старение и онкогенез. Или может выясниться, что заблокировать их размножение по какой-то причине технически невозможно. Но чтобы делать такие выводы, нужно для начала получить вещество-блокатор, которое будет хорошо справляться со своей задачей на молекулярном уровне.

Судя по всему, нынешние лекарства от ВИЧ не очень эффективно ингибируют ORF2p. Хоть он и работает по тому же принципу, что и ревертаза ВИЧ, эти белки могут отличаться небольшими особенностями строения. И совершенно необязательно блокаторы одного фермента хорошо подойдут для другого. Как рассказал N + 1 Илья Ясный, руководитель научной экспертизы венчурного фонда LanceBio Venture, пока ни одного специфичного ингибитора ORF2p в клинических испытаниях не появилось.

Можно было бы сделать универсальный блокатор, который подходит под все возможные ревертазы одновременно. Но тогда появляется еще один риск. Белка ORF2p в человеческих клетках очень мало. Из примерно 500 000 копий L1 активны и размножаются не больше сотни, и белков им для этого нужно совсем немного. Причем ORF1p нужно побольше, чтобы облеплять цепочку мРНК, а концентрация ORF2p еще в 30 раз ниже. И если в клетку добавить универсальный блокатор ревертаз, то есть риск, что он будет связываться и с другими белками, — просто потому, что вероятность добраться до нужной мишени невелика, и по дороге ему могут встретиться другие подходящие молекулы.

Среди таких ложных мишеней может быть один важный человеческий фермент — теломераза. Она тоже относится к ревертазам, потому что использует РНК-шаблон, чтобы достраивать концы хромосом. А блокировать теломеразу опасно, это может только ускорить старение клетки или по меньшей мере вызвать дополнительный стресс. Поэтому, чтобы выяснить, действительно ли ретротранспозоны можно затормозить и тем самым справиться со старением или отдельными болезнями, нужен более точный блокатор, который будет связываться только с ORF2p, игнорируя другие белки.

Можно попробовать доработать имеющиеся лекарства от ВИЧ — то есть перебрать похожие на них молекулы в надежде на то, что какая-то из них окажется более эффективной. А можно пойти другим путем — и начать с нуля: определить структуру ORF2p и точно выяснить, чем она отличается от других ревертаз. То есть в деталях прорисовать мишень, прежде чем в нее прицелиться, — чтобы можно было сразу подбирать лекарство непосредственно под нее.

Но прежде чем построить структурную модель белка, нужно получить его в лаборатории в достаточном количестве — чтобы было достаточно образцов для анализа. Это само по себе непросто, и никому, кто изучает L1, — а этим исследованиям уже не один десяток лет — это до сих пор не удавалось.

Дело в том, что в норме клетки не строят ORF2p в больших количествах. В таких случаях биологи обычно встраивают нужную генетическую конструкцию в клетки кишечной палочки или культуру клеток эукариот. Но с ORF2p это не получалось: то не удавалось заставить клетки его производить, то он выходил некачественным. Поэтому до сих пор ученые восстанавливали его структуру по частям — например, реконструировали отдельно эндонуклеазный домен, который вносит разрывы в ДНК в том месте, куда собирается встроить цепочку L1.

Сейчас, когда молекулярные биологи уже построили модель структуры ORF2p, стало понятно, в чем была проблема. Этот белок многофункциональный — он умеет копировать и ДНК, и РНК, а еще их транспортировать, резать и вставлять. Для этого в нем есть множество доменов, и он не просто большой и сложный, но еще гибкий и подвижный, и весь покрыт положительно заряженными аминокислотами. Это помогает ему удерживать в своем кармане отрицательно заряженные ДНК и РНК, но в то же время мешает аккуратно сворачиваться в неподходящей среде. И когда ученые пытались заставить клетки — например кишечной палочки — его производить, то он принимал неправильную форму или просто слипался в бесформенные агрегаты.

Собери их все

Довести эту работу до конца взялись исследователи из стартапа ROME Therapeutics. Эта компания, согласно ее сайту, «освещает темные участки генома, чтобы разработать новый подход к лечению серьезных болезней». Под темными участками здесь имеются в виду в основном некодирующие последовательности, которые изучены хуже прочих (о том, почему так получилось, мы тоже рассказывали — в материале «Путешествие к центру генома»). В этот список попали и ретротранспозоны L1.

В стартапе знали, что не они одни работают над структурой ORF2p. В частности, они подозревали, что с ними конкурирует Чжан Фэн из Массачусетского технологического института (тот самый, который претендует на звание одного из разработчиков генетических ножниц CRISPR/Cas9 и даже отсудил себе на них патент, хотя Нобелевской премии ему пока не досталось). В лаборатории Чжана давно разрешают кристаллические структуры белков в комплексах с нуклеиновыми кислотами. Но если поначалу это были в основном Cas9 и другие белки, участвующие в редактировании генов, то в последние годы появились и публикации по транспозонам. Было похоже, что Чжан тоже интересуется структурой белков L1.

Чтобы составить конкуренцию лаборатории Чжана и собрать структуру многодоменного белка, исследователи из ROME собрали многодоменную команду. К их работе подключилась группа Мартина Тейлора из Гарвардской медицинской школы — и вместе им удалось заставить клетки насекомых производить качественный ORF2p.

После этого в ROME попытались получить структуру белка с помощью рентгеноструктурного анализа. «Это нетривиальная вещь, — рассказывает N + 1 Артур Залевский из Университета Калифорнии в Сан-Франциско, один из соавторов исследования, — даже если у вас на руках есть белок. Нужно перебрать большое количество условий кристаллизации, потом нужно разрешить структуру». В итоге у исследователей из компании получилась структура активного центра ORF2p. Но поначалу ее никому не показали — чтобы не нарушать коммерческую тайну.

Дальше к команде присоединился еще один домен — лаборатория Майкла Раута из Института Рокфеллера. Ее сотрудники взялись получить структуру того же самого белка с помощью другого метода, криоэлектронной микроскопии. Это тоже оказалось непросто, и снова из-за того, что ORF2p слишком большой и заряженный. «Первая проблема — preferential orientation (предпочтительное расположение — N + 1), — объясняет Залевский. — Вы наливаете образец на [подложку для] криоЭМ, и все молекулы оказываются в одной ориентации. Это не позволяет вам получить хорошую 3D-реконструкцию белка, для нее нужно увидеть объект со всех возможных сторон».

Поэтому Раут и его коллеги попробовали вращать саму подложку, на которой лежал белок. Вышло все равно неравномерно — с некоторых ракурсов ORF2p разглядели лучше, чем с других. Но этого было достаточно, чтобы собрать структуру. Ее показали исследователям из ROME — и те подтвердили, что у них получилось то же самое.

Обе группы работали над структурой одного конкретного участка ORF2p — домена, который работает ревертазой. Но им были интересны и другие части молекулярного швейцарского ножа. И чтобы построить структуру белка целиком, они обратились к третьей группе — в которой работает Залевский.

Залевский и его коллеги взяли данные еще двух методов, чтобы собрать побольше информации об ORF2p. Первый — электронная микроскопия негативного контраста. При этом образец поливают уранил ацетатом, это тяжелая соль, поэтому очертания белка становятся хорошо видны в электронный микроскоп. Второй — химический кросс-линкинг, он помогает понять, на каком расстоянии друг от друга находятся отдельные части молекулы.

После этого исследователи собрали все данные воедино — рентгеноструктурные, криоэлектронной микроскопии, кросс-линкинга и негативного контраста — и попробовали получить такую структуру, которая лучше всего согласовывалась бы с ними со всеми. «Мы разделили данные, — говорит Залевский. — Часть экспериментальных данных использовали для моделирования, а часть — весь негативный контраст — только для валидации результатов. И это получилось на удивление хорошо».

Когда со всеми исследованиями было покончено, и соавторы сели готовить препринт, пришли тревожные новости. В Science появилась статья группы Чжана — правда, про другой ретротранспозон, R2 из генома тутового шелкопряда. Это главный модельный объект среди ретротранспозонов, близкий по структуре к L1.

«Мы, на самом деле, сильно в этот момент перепугались, — вспоминает Залевский. — Это Чжан, человек-институт. Их статья про R2 от отправки до публикации вышла за два месяца. За два месяца, в Science! Было очевидно, что L1 у них на очереди».

Сейчас уже понятно, что испугались ученые зря. «Человек-институт» не успел их догнать. Зато одновременно с их работой в Nature вышла еще одна статья — от группы исследователей из соседнего института с тем, где работает Залевский. И она тоже посвящена структуре ORF2p.

Участников в этой группе было всего четверо, и они поставили перед собой гораздо более узкую задачу: выяснить, как именно ORF2p распознает некоторые нуклеиновые кислоты. Их интересовало, как он выбирает, на какой мРНК строить ДНК-копию и в какое место генома ее вставлять. У этого на первый взгляд фундаментального вопроса есть и практическое измерение: исследователи рассчитывают, что систему на основе ретротранспозонов можно будет однажды применить для генной терапии — чтобы контролируемо встраивать нужные последовательности в подходящие участки генома.

Так же, как и группа Раута, исследователи воспользовались криоэлектронной микроскопией — и построили модель белка в комплексе с РНК. По словам Залевского, у них получились похожие результаты, но конкуренты увидели только одно из возможных состояний белка (а их бывает несколько, потому что домены могут двигаться друг относительно друга). «Когда данные [другой группы] будут доступны, — говорит ученый, — будет безумно интересно детально сравнить структуры и, возможно, где-то даже улучшить нашу модель».

Далее — везде

Теперь, казалось бы, с ORF2p можно делать практически что угодно. Можно разработать тест-систему, чтобы искать его в клетках, можно следить за его перемещениями по клетке и вычислять, с чем он связывается.

Кроме того, можно лучше понять, как он работает. До недавнего времени, например, было неочевидно, как именно ORF2p встраивает копию L1 в конкретное место генома. Вот он подплывает к ДНК, разрезает ее — и что происходит дальше? Сейчас стало ясно, какими участками белок держится за ДНК — и исследователи нарисовали схему того, как он перекидывает цепочки нуклеиновых кислот между своими доменами. А каждый этап работы белка — это шанс подобрать новое лекарство против L1, потому что для каждого молекулярного движения теоретически существует молекулярный блокатор.

Наконец, теперь структуру ORF2p можно сравнить со структурой других ревертаз. В частности, соавторы выяснили, что активный центр этого фермента — очень консервативен, он похож на все прочие ревертазы. Но если сравнивать структуру целиком, то оказывается, что его ближайшие аналоги — кроме белка R2 из генома тутового шелкопряда — ревертазы вирусов гепатита С и гриппа и теломераза, а ревертаза ВИЧ уже подальше. При этом у ORF2p обнаружился уникальный домен на С-конце белка — он, предположительно, отвечает за связывание с ДНК хозяина и совсем не похож на свои аналоги у других ревертаз. Почему так получилось, пока неясно.

Дальше дороги соавторов исследования разделятся — одни отправятся уточнять принцип работы ORF2p и проектировать эксперименты, которые позволят подтвердить или опровергнуть их предположения. А другие начнут подбирать и проверять специфичные блокаторы для этого белка. И вот это может оказаться совсем непросто.

Кандидата в лекарство ждут клетки, мыши и другие экспериментальные животные, за ними клинические испытания — а потом проверки регуляторных органов. И каждый из этих этапов может затянуться надолго. В случае с лекарством от старения это произойдет почти наверняка — с учетом того, что никто еще не придумал, как его проверить на практике.

Но чтобы снизить вклад ретротранспозонов в старение, может понадобиться больше, чем один препарат. На завершающем слайде своего доклада в Казани Андрей Гудков, поверх фона из «Источника молодости» Лукаса Кранаха Старшего, поместил свой рецепт воды для такого источника. В него, помимо ингибиторов ревертазы, Гудков предлагал включить еще три молекулы: ингибиторы эндогенной нуклеазы (участок ORF2p, который отвечает за разрезание ДНК), стимуляторы TLR5-рецепторов (рецепторы на клетках врожденного иммунитета; предполагается, что после стимуляции они активируются и смогут уничтожать старые клетки) и вакцины против клеток, в которых размножается L1.

Так что для начала ROME Therapeutics целится в более изученные — и признанные медициной — болезни: опухоли и аутоиммунные патологии. Но какую именно молекулу и против какой именно болезни проверяют в стартапе, исследователи не рассказывают даже своим соавторам. «У них в пайплайне несколько малых молекул, — рассказывает Залевский, — часть данных они согласились представить в статье, но в работе у них гораздо больше всего». И пока эти данные не опубликованы, невозможно предсказать, сколько времени им понадобится и дойдет ли этот препарат до клиники.

«Как и тысячи других стартапов, этот пока на уровне клеток, — говорит Илья Ясный, — поэтому вероятность добраться до рынка — чисто статистически менее процента. Время — в районе 7–10 лет, но это очень непредсказуемо». Но и недооценивать новую работу, по его словам, не стоит: «Это та среда, из которой потом вырастают лекарства, и заранее никто не может сказать, что именно выстрелит».