Чип спешит на помощь

Биомедицинские исследования — от разработки вакцин до изучения редких генетических болезней — это миллиарды долларов и сотни тысяч специалистов. Годы и даже десятки лет труда. И миллионы лабораторных животных. При этом последние идут в науку не по своей воле и редко оказываются «меньшими научными сотрудниками» ради блага именно своего вида (хотя лекарствами и вакцинами для животных люди тоже занимаются — просто не в первую очередь). Разбираемся, почему ученым все еще сложно обойтись без подопытных мышей, а где уже можно заменить модельные организмы системами из живых клеток на кремниевой подложке.

15 июля правительство Великобритании отчиталось о том, что в 2020 году в экспериментах британских ученых было использовано 800 с лишним тысяч мышей, 198 тысяч крыс, 189 тысяч рыб, 2 с лишним тысячи кроликов и 146 кошек. Всего через лаборатории прошло 1,4 миллиона модельных организмов — столько же людей живет в Екатеринбурге. Почти 800 тысяч животных в процессе экспериментов либо умерли, либо серьезно пострадали (из соображений гуманности таких животных обычно также умерщвляют по итогам исследований). Британцы отмечают, что общее число «живых расходников» для экспериментов оказалось на 15 процентов меньше, чем в 2019-м — однако объясняется это в основном не гуманизацией научных практик, а тем, что многие лаборатории из-за пандемии ковида просто приостановили свои исследования.

Великобритания — вторая на планете страна по объему биомедицинских исследований, поэтому подобные цифры для большинства других стран (за исключением разве что США и Китая) будут меньше. Общей статистики по всему миру никто не ведет, хотя, по некоторым оценкам, в 2015 году «меньшими научными сотрудниками» стало почти 200 миллионов животных.

Зачем нужны мыши

Словосочетание «опыты над животными» ассоциируется обычно с белыми лабораторными мышами. Хотя в лабораторных исследованиях также используют крыс, морских свинок, хомяков, голых землекопов, кроликов, кошек, собак, обезьян и некоторых других животных. Мыши так популярны потому, что они невелики, относительно дешевы, неприхотливы и плодовиты. Кроме того, подавляющая часть их генов так или иначе сходна с человеческими.

Лабораторные мыши (как и другие модельные животные) выводятся для экспериментов специально. Для разведения и содержания животных при медико-биологических учреждениях существуют так называемые виварии — здания или отдельные помещения, предназначенные для содержания лабораторных животных. Условия содержания животных в виварии четко регламентируется — вплоть до рекомендуемого процента относительной влажности помещения (50-65 процентов для основных видов лабораторных животных).

Сегодня «дикие» мыши в лаборатории — редкое явление. Все в той же Великобритании в 2020 году помимо 1,4 миллиона животных, прошедших через эксперименты, еще стольким же отредактировали геном для того, чтобы они подходили для тех или иных исследований.

Генно-модифицированные мыши это, как правило, животные с какими-то включенными (knock-in) или выключенными (knock-out) генами — полностью или при определенных условиях (Cre-lox, «условный knock-out»). В некоторых случаях выключение активности того или иного гена проявляется фенотипически, благодаря чему удается понять, за что ответственен выключенный ген. Таким образом, исследователи, работая с такой генно-модифицированной мышью, могут понять, как подобный ген может вызвать или способствовать развитию того или иного заболевания. Так можно изучать и человеческие заболевания, даже очень редкие — вы просто редактируете геном мышей и получаете большую группу для наблюдения и экспериментов (о создании в России трансгенных мышей для исследований COVID-19 подробнее читайте в материале «Болейте за нас»).

Например, гомозиготные мыши линии ApoE^−/−, то есть полностью лишенные гена, кодирующего белок ApoE (Аполипопротеин E, участвует в транспорте холестерина) — бесценные помощники в доклинических исследованиях влияния того или иного агента на сердечно-сосудистую или дыхательную системы. Такие мыши развиваются абсолютно нормально, однако у них очень медленно выводятся из организма липопротеины, примерно в пять раз выше содержание холестерина в крови и повышена вероятность возникновения спонтанных атеросклеротических поражений даже при нормальной диете.

Хоть у ApoE^−/− мышей атерогенез и ускорен по сравнению с человеком, эта модель позволяет оценить механизмы, лежащие в основе прогрессирования атеросклероза. Ученые PMI Science так же показали, что с помощью этих мышей можно оценивать риски развития не только атеросклероза, но и воспаления легких, эмфиземы и некоторых других патологий.

Проблема незаменимости

В случае разработки новых лекарств модельные организмы используются на этапе доклинических исследований. Этот этап строго обязателен для того, чтобы разрабатываемый препарат в принципе мог получить регистрацию в качестве лекарственного средства (об устройстве клинических испытаний мы подробно писали в материале «Последняя проверка»).

Более того, требования и рекомендации по проведению клинических исследованиях жестко фиксируют тот факт, что у нас нет никакого другого способа изучать болезни или испытывать лекарства, кроме как работая с модельными организмами. В России для того, чтобы получить разрешение на клинические испытания, нужно в обязательном порядке предоставить «сводное изложение результатов доклинических исследований». Биологи и медики, отказавшись от мышей, крыс, приматов и других лабораторных животных, будут вынуждены либо свернуть исследования — либо рискнуть здоровьем и жизнями людей (чего им, естественно, никакой регулятор никогда не позволит).

Научное сообщество, конечно, осознает этическую проблему экспериментов над животными. Современный ответ на нее — это концепция 3R (Reduction, Replacement, Refinement), то есть «сокращение, замена и усовершенствование».

• Сокращение означает применение методических подходов, позволяющих получить больше информации от работы с меньшим количеством лабораторных животных.
• Принцип замены подразумевает переход на альтернативные методы, позволяющие достичь необходимой цели без проведения экспериментов с участием животных.
• Под усовершенствованием понимают использование методов, исключающих или вызывающих минимальный дискомфорт у животных.

Уже сегодня многие организации регулируют и регламентируют использование лабораторных животных, либо распространяют информацию об альтернативных исследованиях и помогают в разработке новых методов. Референсная лаборатория Европейского Союза по разработке альтернатив тестированию на животных (EURL-ECVAM) проверяет и разрабатывает методы альтернативной токсикологии. В Великобритании научная организация NC3R помогает исследователям соблюдать принципы 3R. Norecopa — независимая национальная платформа Норвегии, которая распространяет принципы 3R и создает свою собственную открытую для всех базу данных, касающихся методов альтернативной токсикологии.

На принципы 3R ориентируются и многие крупные международные компании. Например, GlaxoSmithKline (GSK), одна из крупнейших фармацевтических компаний в мире, уже заменила некоторые свои исследования на животных компьютерным моделированием и тестами in vitro. Novartis, транснациональная фармацевтическая корпорация, также поддерживает принципы 3R — благодаря использованию трехмерной культуры клеток для воспроизведения ключевых особенностей регенерации печени, ученые Novartis значительно сократили количество грызунов, необходимых для исследования, а применение клеток печени в качестве in vitro модели для скрининга лекарств против печеночной стадии малярии позволило вообще отказаться от исследованиях на приматах. Philip Morris International (PMI) работает над тем, чтобы максимально заменить испытания на животных альтернативными подходами. В 2019 году PMI сотрудничала с 37 компаниями, чтобы обучить сотрудников альтернативным методам оценки ингаляционной токсичности, не требующим участия животных.

В феврале 2020 года американский регулятор FDA выпустил проект руководства по доклиническому применению лекарств и биопрепаратов. В этом проекте FDA рекомендуют использовать методы in vitro, in chemico (методы абиотической химической реактивности) и in silico вместо in vivo тестов. А поскольку США — лидер по объему биомедицинских исследований, причем с огромным отрывом, эффект рекомендаций FDA почувствует значительная доля тех самых двухсот миллионов (а то и больше) модельных организмов.

Вместо мыши — клетки

Работа с животными, кроме этических проблем, имеет ряд и других ограничений. Модельные организмы не полностью могут воспроизвести организм человека и присущие ему особенности. По этой причине оценка эффективности и безопасности препаратов в экспериментах с участием животных иногда оказывается не применимой по отношению к человеку.

Неплохой альтернативой являются клеточные культуры. Сегодня возможно культивировать широкий спектр различных клеток, в том числе из разных тканей и разных организмов, включая человека.

Одной из самых первых выделенных культур клеток человека была клеточная линия HeLa. Эта линия была получена в 1951 году из раковой опухоли шейки матки Генриетты Лакс (Henrietta Lacks), умершей от этого заболевания в том же году.

Особенность этой культуры в том, что она бессмертна, то есть клетки этой линии способны делиться неограниченное число раз, в отличие от обычных здоровых клеток, имеющих предел Хейфлика (это граница количества делений соматических клеток). Как и бывает при многих типах раковых опухолей, клетки HeLa синтезируют фермент теломеразу, которая наращивает теломеры на концах ДНК хромосом, что и позволяет им делиться «вечно».

Сейчас ученые культивируют не только раковые клетки. Обычно культуры клеток подразделяют на два типа: первичные, то есть выделенные непосредственно из живых тканей, и иммортализованные — примером таких как раз является линия HeLa. Ученые умеют работать с большим разнообразием клеточных линий практически всего, чего угодно, в том числе эпителия и клеток из эмбриональных почек человека. Есть целые базы данных существующих клеточных линий, в которых можно найти подробную информацию о характеристиках клеток, откуда они были получены, как их культивировать и какими особенностями они обладают.

Преимущество клеточных in vitro моделей заключается в том, что тесты на них быстры, недороги и позволяют изучить специфические механизмы действия исследуемых соединений. Однако традиционные культуры клеток, выращенные в культуральных чашках (адгезионные, то есть прикрепленные) или колбах (суспензионные) ограничены тем, они слишком далеки от реальных условий, свойственных человеческому организму. 2D-культуры — выращенные на дне чашки Петри — не могут полностью имитировать физиологические условия межклеточного взаимодействия, которые клетки испытывают в реальных условиях.

Чтобы решить эти проблемы, в последние годы исследователи искали способы культивирования клеток в системах, более приближенных к физиологическим. Тогда пришла идея разработать 3D-модели клеток, более физиологично взаимодействующих друг с другом.

В этой области ученые уже успели добиться определенных успехов. Сегодня 3D-модели широко используются для оценки эффективности и токсичности лекарств. Успешным примером может послужить клеточная система hBR-ALI. Эта культура представляет собой человеческую бронхиальную 3D-органотипическую культуру. За счет создания границы раздела фаз воздуха и жидкости ученые постарались приблизиться к реальным условиям в бронхах, где воздух контактирует с легочной тканью. Данная модель позволяет формировать поляризованный эпителий, состоящий из базальных, реснитчатых и бокаловидных клеток. hBR-ALI помогает в in vitro исследованиях особенностей эпителия дыхательных путей, так как эта культура морфологически соответствует микросреде дыхательных путей человека.

Добавим немного кремния

Ученые на этом не остановились и решили не ограничиваться только объединением отдельных клеток, а сделать настоящую инженерную систему, которая имитировала бы реальный орган. «Органы-на-чипе» имитируют естественные условия для трехмерных клеточных культур, фактически мини-органов. Хотя каждый тип органа-на-чипе отличается, чтобы должным образом имитировать конкретный орган, многие из их характеристик одинаковы: они часто состоят из «отсека кровеносных сосудов», содержащего эндотелиальные клетки, и «отсека органа», содержащего клетки интересующей ткани или органа. Между отсеками обычно есть пористая полимерная мембрана для достижения клеточной адгезии, разделения клеток и связи клеток между двумя отсеками.

In vitro системы орган-на-чипе также называют микрофлюидными или микрожидкостными. Это сеть микроканалов, вытравленных или отлитых в материале подложки — как правило, в полимере, который прикреплен к предметному стеклу.

Эти системы позволяют имитировать физиологические и патологические градиенты концентрации компонентов микросреды органов. Последние достижения в этой области также позволили разработать механически активные микросистемы, которые могут воспроизводить специфический для органа поток жидкости и механическую деформацию для моделирования патофизиологии живых органов. Например, с помощью таких микросистем можно растягивать покрытые клетками мембраны, имитируя перистальтику кишечника или дыхательное движение легких.

Ученые также могут использовать модульные приборы для введения лекарственных средств, разных химических веществ и токсинов в «окружающую среду» чипа для проверки реакции и поведения органа. Это происходит через трубки или простые отверстия с помощью регуляторов давления, шприцов, насосов. В некоторых случаях чипы могут быть соединены, чтобы понять, как несколько органов работают вместе и как могут влиять на биологию друг друга. Также микрофлюидные устройства могут быть технически усложнены путем интегрирования с электродами и разными наноструктурами.

Ученым из отдела исследований и разработок PMI Science удалось культивировать на чипе трехмерные культуры клеток легких вместе с клетками печени человека. В такой системе культуры клеток связаны между собой через специальный жидкостный канал, причем скорость и направление циркуляции культуральной среды можно контролировать даже со смартфона. Эти жидкостные каналы позволяют разделять среды между культурами и симулировать их связь без соприкосновения клеток напрямую — все почти как в жизни, ведь клетки легких человека не касаются клеток печени, но при этом функционально они связаны.

Для имитации печени ученые использовали клеточную линию гепатоцитов — клеток печени. Легкое моделировали по похожему принципу, о котором мы писали выше, говоря про hBR-ALI: в итоге получилась 3D-структура с такими же типами эпителиев. Используя систему «легкие/печень-на-чипе», ученым удалось продемонстрировать тесную связь легких и печени. Они добавляли в систему афлатоксин B1, токсин печени и канцероген, вырабатываемый некоторыми грибами — клетки печени нейтрализовали действие токсина, защитив «легкие» от токсических эффектов. Такая система довольно реалистично демонстрирует функциональную связь между легкими и печенью человека и открывает возможности для ряда доклинических испытаний.

От органов к телу

Следующим ожидаемым этапом после «органов-на-чипах» стала разработка настоящего «тела-на-чипе», то есть еще более сложной и многогранной инженерной системы, позволяющей имитировать не просто взаимодействие пары отдельных органов, а практически целого организма, полиорганной системы.

Ученые Института Висса при Гарвардском университете создали уже целого «человека-на-чипе»: в 2020 году они представили высокомодульную платформу Interrogator, которая может обеспечить культивирование до десяти различных органов-на-чипе и может последовательно пропускать жидкости между «сосудами», покрытыми клетками эндотелия (такая цепочка имитирует нормальный человеческий кровоток между органами).

Система Interrogator удивительна потому, что она позволяет культивировать, перфузировать и связывать «органы» человека, проводя все манипуляции полностью программируемым автоматизированным способом. То есть это не просто система, связывающая различные «органы», это настоящий робот, набирающий пипеткой жидкости, переносящий их и производящий при этом мониторинг с помощью встроенного микроскопа и камеры. Сложно описать словами то, что происходит в процессе работы этого аппарата. Лучше посмотреть видео:

Ученые из Гарварда не оставили без внимания и COVID-19. Они разработали in vitro систему органа-на-чипе, которая имитирует дыхательные пути легких человека. С помощью этой системы ученые выявили ингибирующие SARS-CoV-2 эффекты противомалярийного препарата амодиахина, в настоящее время проходящего клинические испытания.

Многие научные группы по всему миру прямо сейчас тестируют существующие лекарства на эффективность против COVID-19, применяя обычные, «плоские» клеточные системы — но вы уже отлично понимаете, что клетки, выращенные в чашке Петри, не ведут себя так же, как клетки в организме живого человека. По этой причине многие лекарства, которые кажутся эффективными на стадии доклинических исследований, на пациентах не работают.

Ученые исследовали восемь существующих лекарств, включая гидроксихлорохин и хлорохин (их активно применяли в первую волну пандемии), которые, как они и многие другие ученые обнаружили, активны против SARS-CoV-2 в обычных in vitro тестах на клеточных культурах. Однако при тестировании их на более сложной системе — «легких-на-чипе», инфицированных псевдотипированным вирусом SARS-CoV-2, ученые обнаружили, что большинство этих препаратов, включая гидроксихлорохин и хлорохин, были неэффективными (подробно о том, как эти противомалярийные препараты пытались приспособить к лечению ковида, мы рассказывали в материале «Колесо злоключений»).

Зато другой противомалярийный препарат, амодиахин, оказался высокоэффективным в предотвращении проникновения вируса. Затем эти результаты были подтверждены на культивируемых клетках и на модели COVID-19 на лабораторных животных с использованием инфекционного вируса SARS-CoV-2.

А ученые из Технического университета Берлина и Института Фраунгофера в Дрездене совместно с исследователями российского научно-технического центра «БиоКлиникум» уже продолжительное время занимаются разработкой целого «человека-на-чипе». Главным результатом партнерства биологов из Германии и российских инженеров стал микробиореактор «Гомункулус», позволяющий моделировать работу системы из шести, а в перспективе — и десяти разных клеточных моделей тканей и органов (подробнее о нем — в материале «Потренируемся на чипах»).

Однако, по словам самих разработчиков «Гомункулуса», нет строгой необходимости в том, чтобы собирать целого «человека-на чипе». Достаточно более или менее полно имитировать работу отдельных систем организма, которые важны для конкретных задач медицины и фармакологии.

Другой интересный проект «БиоКлиникум» — микрофизиологическая модель человеческого плацентарного барьера, или плацента-на-чипе. Плацента — высокоспециализированный орган, который играет в человеческом организме важную роль при беременности. По оценкам разных экспертов, лишь 15 процентов препаратов одобрены для применения в процессе беременности, так как у исследователей недостаточно информации о проницаемости их препаратов и влиянии на развивающийся плод.

Почти наверняка вы слышали о такой проблеме даже в контексте вакцинации против COVID-19 или, может быть, читая инструкции к любым другим лекарственным препаратам. Как правило, даже безобидные препараты могут быть противопоказаны беременным по причине отсутствия формальных данных об их влиянии на будущую мать и ее ребенка. Подобная in vitro система значительно помогла бы в разработке препаратов, допустимых для приема во время беременности.

Можно без мышей?

Сложные in vitro системы вроде орган- или тело-на-чипе — большой технологический шаг в медицинских исследованиях. Смогут ли они совсем заменить, например, доклинические тесты с участием животных? Это достаточно спекулятивный вопрос — сейчас сложно предвосхитить пределы технологического прогресса. Некоторые ученые предполагают, что до тех пор, пока in vitro модели не смогут воспроизводить системные реакции организма, испытания на животных останутся неизбежными.

Сегодня «органы-на-чипе» неплохо имитируют некоторые органы и их функции, чтобы моделировать на них «простые» заболевания и клеточно-специфические эффекты лекарств. Однако это когда мы переходим к многофакторным, и в том числе хроническим заболеваниям, все становится намного сложнее.

Применение «чипов» особенно ограничено в области изучения нейродегенеративных заболеваний — это слишком сложные состояния для моделирования in vitro. Пока мы не можем имитировать все тело, а воспроизводим лишь различные различные специфичные отдельно взятых органов. Корректнее даже будет сказать — не органа, а культур клеток в конкретных экспериментальных условиях.