Болейте за нас

В Институте биологии гена РАН создают первую «партию» генно-модифицированных мышей, которые болели бы COVID-19 как люди. Животные в июне отправятся на эксперименты под Новосибирск — в вирусологический центр «Вектор», которому подобные манипуляции разрешены Роспотребнадзором. О том, зачем нужны «коронавирусные» мыши, и с какими сложностями могут столкнуться исследователи при их создании, N + 1 рассказал Алексей Дейкин, руководитель Центра коллективного пользования «Геномное редактирование» ИБГ РАН.

Почему мыши

Мыши и крысы слабо подвержены заражению новым коронавирусом. Теоретически, можно дать им настолько большую вирусную нагрузку, что у них возникнут симптомы, но это будет абсолютно не соответствовать тому, как болеет человек: вероятнее всего, они просто начнут терять массу, не более того. С этой проблемой столкнулись еще в 2003 году, когда была вспышка первого SARS. Тогда тоже создавали генетически модифицированных мышей, которые были бы чувствительны к этому вирусу.

Лабораторных животных, которых можно было бы использовать в качестве полноценных моделей для изучения коронавирусной инфекции, практически нет. Коронавирусом SARS-CoV-2 могут заражаться хорьки, обезьяны, есть данные о том, что заражаются хомяки — и способны заражать друг друга.

Но для полноценной работы по разработке средств от COVID-19 необходимо соблюсти два условия. 

1. На модельном организме должно воспроизводиться «человеческое» течение болезни — весь ее патогенез, который свойственен именно человеку. 

2. Чтобы получить статистически значимые результаты о безопасности и эффективности лекарства или вакцины, чтобы обнаружить все, даже очень редкие побочные эффекты, нужны тысячи, а то и десятки тысяч подопытных животных.

И в случае с SARS-CoV-2 оба эти условия пока не выполняются ни для одного модельного организма.

У тех же хорьков нет обычной для человека респираторной симптоматики, они не кашляют. У них реализуется желудочно-кишечный фенотип болезни. А у людей кишечные симптомы далеко не самые частые и не самые главные. Следовательно, проверка человеческого лекарства на хорьках не будет вполне показательной.

Патогенез болезни у обезьян больше похож на человеческий, но здесь возникает вторая проблема. Очень важно, чтобы эксперименты на животных были достоверными, чтобы мы увидели реальную смертность, реальную вероятность побочных эффектов.

Представьте, что у вакцины вероятность какого-то тяжелого побочного эффекта один случай на 10 тысяч. Вы провели эксперимент на тысяче животных, на тысяче человек, и не увидели этот эффект.

А потом эту вакцину получают 100 тысяч человек – и это потенциальные десять смертей. А если речь идет о миллионах людей? Единственным надежным инструментом здесь могут быть массовые проверки на лабораторных животных.

Эксперимент даже на тысяче обезьян невозможно представить. Сейчас, например, «Вектор» купил 20 обезьян, и больше в российских питомниках обезьян нет. Даже на тысяче хорьков исследование малореально, потому что это очень агрессивные животные, которых сложно содержать. А вот тысячу мышей можно поместить в комнату площадью 20 квадратных метров.

Трудности трансгенеза

«Старый» SARS-CoV для проникновения в клетку использует рецептор ACE2 на поверхности эпителия верхних дыхательных путей и легких. В 2005-2007 году было создано несколько модельных мышей, которые, к сожалению, оказались неудачными. Во всех случаях ученые пытались путем трансгенеза экспрессировать человеческий ACE2 в организме мыши, но под разными регуляторными элементами, которые заставляли бы рецептор синтезироваться в большем или меньшем количестве. О тканеспецифичной экспрессии ACE2  — то есть чтобы тот появлялся только, собственно, в легких — исследователи не задумывались. Поэтому рецептор экспрессировался и там, где, по идее, не должен, — например, в мозге.

Из-за того что генетическая кассета с ACE2 встраивалась случайно, эти мыши после инфицирования болели очень по-разному. В зависимости от количества встроившихся копий гена они или не показывали вообще никаких симптомов, или наоборот, в муках умирали на второй-третий день после инфекции — в первую очередь, от поражения мозга.

Китайцы сделали трансгенную мышь, у которой экспрессия человеческого ACE2 контролировалась человеческим же промотором. Это должно было обеспечить его более правильную работу, соответствующую работе гена у человека. Эти мыши заражались первым SARS, но болели очень слабо: среди симптомов были только снижение массы тела и вялость. А новым коронавирусом они заражаются еще слабее – болезнь протекает практически без симптомов.

В 2013 году появились сообщения, что для проникновения вируса в клетку нужен не только рецептор ACE2, но и второй белок, TMPRSS2. Это сериновая протеаза, которая активирует белок на поверхности вируса, за счет этого запускается альтернативный путь проникновения вируса в клетку.

На культуре клеток было показано, что ингибитор, препятствующий связыванию TMPRSS2 с вирусом, блокирует заражение клеток. Это означает, что путь, связанный с взаимодействием TMPRSS2 и ACE2, может быть даже более важен, чем проникновение с помощью ACE2.

Это подтверждается статьей в Nature, вышедшей 26 апреля, где сравниваются профили экспрессии ACE2 и TMPRSS2. Там было показано, что страдают именно те клетки, где эти два гена, два белка экспрессируются одновременно. Это эпителий верхних дыхательных путей, альвеолоциты второго типа, клетки роговицы глаза, несколько меньше в кишечнике и в тестикулах. Эти два рецептора все чаще упоминаются вместе, если речь идёт про COVID-19. Но на сегодняшний день животного-модели с этими двумя «очеловеченными» генами нет.

Мы считаем, что желательная — не знаю, насколько идеальная — животная модель COVID-19 должна характеризоваться тремя признаками. 

• Первое: чтобы у них были оба гена, ACE2 и TMPRSS2.

• Второе: чтобы эти гены экспрессировались так же, как у человека, в определенных тканях.

• Третье: чтобы они не экспрессировались тогда, когда нам это не нужно, то есть за пределами вирусологической лаборатории.

Коронавирусность по сигналу

Возможность «выключать» способность заражаться коронавирусом в условиях пандемии необходима — на этих мышей может кашлянуть лаборант, и если они будут такие чувствительные, то заболеют и умрут безо всякого толка. А по некоторым данным, у очень многих людей болезнь протекает бессимптомно.

Наши опасения подтверждаются ситуацией в Нидерландах, где в 20-х числах апреля были закрыты норковые фермы. Норки чувствительны к заражению этим вирусом: они заразились от персонала, начали массово гибнуть. Фермы закрыты — вплоть до того, что навоз вывозить некому.

Чтобы такого в наших питомниках не случилось, где мышей размножают, или не случилось в процессе транспортировки, мы создаем мышей, где экспрессия человеческих генов запускается по сигналу.

Здесь мы используем технологию с использованием вирусного фермента Cre-рекомбиназы. Этот белок узнает в геноме определенные последовательности, которые называются LoxP-сайты, и использует их для вырезания куска ДНК. То есть, если мы какой-то генетический элемент окружим этими LoxP и затем включим экспрессию Cre-рекомбиназы, этот элемент вырежется.

Этой технологии уже 20-30 лет. Есть большое количество мышей, которые в разных органах и тканях экспрессируют Cre-рекомбиназу. Есть мыши, у которых, например, в тканях лёгких экспрессируется Cre-рекомбиназа, а в печени не экспрессируется. Причем есть мыши, где экспрессия этой Cre-рекомбиназы запускается только после того, как, например, мышь накормили антибиотиком доксициклином. Их не нужно создавать, их можно просто купить.

Мы собираем такую генетическую конструкцию. Она будет состоять из кодирующих последовательностей двух человеческих белков, TMPRSS2 и ACE2. Между ними будет регуляторный элемент, который обеспечит их одновременную работу в клетке. А перед ними будет стоять стоп-кассета, окруженная LoxP-сайтами. Вот эта конструкция вставляется в геном мыши в область, где находится ее собственный ген TMPRSS2.

Когда клетка дифференцируется, становится, например, альвеолоцитом второго типа, она запускает экспрессию характерного для нее гена, этого TMPRSS2. Но когда начинает работать промотор TMPRSS2, он начинает сканировать нашу конструкцию. А под мышиным промотором начинает работать два человеческих гена. Но начнут они работать только тогда, когда будет удалена стоп-кассета, которая находится между ними и промотором. А удалена она будет только после скрещивания с соответствующими Cre-мышами.

У итоговой мыши в одной хромосоме под собственным мышиным TMPRSS2-промотором стоят два человеческих гена, заблокированные стоп-кассетой. А в другую хромосому вставлена Cre-рекомбиназа, которая экспрессируется под действием антибиотика доксициклина.

Такую мышь привезут в «Вектор», дадут доксициклин, и тогда в ее организме включится Cre-рекомбиназа. Она уберет стоп-кассету перед человеческими генами именно в легких. Легочный промотор начнет работать, эти гены появятся на поверхности легочных клеток, и мышь станет чувствительна к коронавирусу.

Порядок действий

Первый этап работы — молекулярно-биологическое клонирование, сборка генетических кассет. Конструкцию с ACE2 мы уже получили, большое спасибо коллегам из МГУ и Петру Владимировичу Сергиеву, который смог этот ген синтезировать сам. Мы работаем с геном, который мы получили de novo в России. Сейчас мы занимаемся наработкой гена TMPRSS2. Это чуть сложнее.

Второй этап — микроинъекция кассет в оплодотворенные яйцеклетки мышей.

Технологическая последовательность выглядит так: сначала мы получаем самок классических лабораторных мышей,  маленьких, неполовозрелых — и вызываем у них суперовуляцию.

От каждой такой 12-граммовой самки мы можем получить до 50 яйцеклеток. Когда сперматозоид проникает внутрь яйцеклетки, формируется мужской пронуклеус, в яйцеклетке уже есть женский пронуклеус. И мужской пронуклеус в яйцеклетке приближается к женскому пронуклеусу, они сливаются, и начинается деление. В момент, когда в клетке два пронуклеуса, мы ввводим в нее генетическую конструкцию, которую мы создали. Это матрица для репарации, то есть копии этой конструкции мы будем встраивать в геном мышей. Помимо нее, мы вводим и другую плазмиду — она содержит геноредактор, систему CRISPR/Cas9. В ней же закодирована гидовая РНК, которая указывает Cas9, где резать — в области TMPRSS2-промотора. Благодаря этой схеме наша кассета вставится не куда попало, а в конкретное место генома.

Яйцеклетка оценивается на жизнеспособность, в течение какого-то времени культивируется. Если клетка выжила, она пересаживается самке-реципиенту. Ее хирургически переносят в воронку яйцевода, то есть в самое начало репродуктивного пути мыши. Мышь зашивается, оставляется на содержании. Через три недели она рожает мышат.

18 мая у нас должны родиться первые трансгенные мышки, у которые будет только ген ACE2. TMPRSS2-мыши родятся до конца июня.

В зависимости от того, насколько эффективно вся эта система сработала, мы обнаруживаем в геноме этих мышат нужную нам модификацию. Первое потомство (первичный трансген) в работу не идет. Их скрещивают между собой, получаются потомки, и уже они характеризуются — сколько копий нужного гена, куда что встало. И уже они скрещиваются с Cre-мышами. И вот потомки трансгенов и Cre-мышей, содержащие и трансген, и Cre-рекомбиназу, дальше пойдут в работу по заражению вирусом.

Рождения мышей уже с двумя генами — и ACE2 и TMPRSS2 — мы ожидаем в начале июня. Мы можем их в «Вектор» отправить, или их потомков. В любом случае, в конце июня они там окажутся. Окончательный ответ на вопрос, заболеют ли эти мыши коронавирусом, и какие у них будут симптомы, можно будет получить только там.

Подготовили Сергей Кузнецов, Дарья Спасская