Токсоплазма доставила терапевтические белки в нейроны

Ученые использовали внутриклеточного паразита Toxoplasma gondii для доставки терапевтических белков в нейроны. Они отредактировали системы секреции токсоплазмы так, чтобы она секретировала гибридные белки, и продемонстрировали доставку таких белков в культивируемые нейроны, органоиды мозга, а также в мозг живых мышей. В частности, им удалось доставить в нейроны сшитый с белком токсоплазмы GRA16 белок MeCP2, необходимый для нормальной работы нервных клеток: мутация в гене этого белка приводит к нарушению работы мозга у девочек с синдромом Ретта. Результаты опубликованы в Nature Microbiology.

Доставка белков к органам мишеням — сложная задача, поскольку белки часто нестабильны вне клетки, а также, попадая в организм, могут вызывать нежелательные иммунные реакции. Кроме того, различные биологические барьеры препятствуют свободному прохождению молекул через них. Так, чтобы проникнуть в центральную нервную систему, белки должны пройти через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) — это почти невозможно, так как белки крупные, а часто и гидрофильные молекулы, для которых ГЭБ непроницаем. Чтобы преодолеть эти ограничения, исследователи используют различные носители — наночастицы, липосомы и экзосомы. Однако эти подходы не всегда эффективны и чаще всего применяются к пептидам или внеклеточным белкам, а не к полноразмерным белкам, функционирующим внутри клетки.

Шахар Браха (Shahar Bracha) из Тель-Авивского университета с коллегами из Великобритании, Израиля, Италии, США и Швейцарии решила использовать для доставки белков в нейроны внутриклеточного паразита — Toxoplasma gondii. Токсоплазма легко проникает через ГЭБ и заражает нейроны. Кроме того, у нее есть органеллы, секретирующие белки — роптрии и плотные гранулы. Сначала исследователи сшили гены нескольких белков, имеющих терапевтический потенциал для лечения неврологических заболеваний человека, с генами белков, секретируемых T. gondii. Для секреции белков через роптрии ученые сшивали терапевтические белки с токсофилином, а для доставки через плотные гранулы — с белком GRA16. На выходе должны были получиться гибридные белки.

Затем ученые проверили наличие этих белков в роптриях и плотных гранулах T. gondii, а также в цитозоле хозяина (на этом этапе T. gondii культивировались в линии дермальных фибробластов человека HFF). Три из одиннадцати протестированных белков, сшитых с токсофилином, локализовались в роптриях — CDNF, PARK2 и TFEB. Однако обнаружить эти белки в клетках-мишенях не удалось, несмотря на то, что белки из роптрий попадают непосредственно в клетку-мишень. По всей видимости, уровень секреции или активность этих гибридных белков были недостаточными.

Белки, секретируемые плотными гранулами, сначала попадают в паразитофорную вакуоль, и затем должны преодолеть мембрану этой вакуоли. Три из девяти гибридных белков локализовались внутри этой вакуоли, но не в клетке мишени. Еще три ядерных белка, SMN1, TFEB и MeCP2, сшитые с GRA16, локализовались как внутри вакуоли, так и в ядре клетки-хозяина. Молекулярная этих гибридных белков варьировала от 88 до 110 килодальтон — то есть они были довольно крупными. Наиболее надежную доставку показали TFEB и MeCP2, поэтому далее ученые сосредоточились на них. Анализ кинетики инфекции и доставки белка показал, что через 24 часа после заражения от 50 до 62 процентов дермальных фибробластов человека были инфицированы токсоплазмой, и в 73–86 процентах из них обнаруживались белки — GRA16, GRA16-MeCP2 и GRA16-TFEB. Ядерные уровни гибридных белков были в восемь раз ниже чем уровни одного GRA16, то есть количество доставленных гибридных белков было ниже, чем количество доставленного белка паразита.

Затем ученые заразили T. gondii зрелые дофаминергические нейроны человека in vitro и показали, что GRA16-MeCP2 и GRA16-TFEB успешно доставляется и в эти клетки. Через 24 часа после инокуляции уровень MeCP2 в нейронах с нокаутом гена MECP2 достигал 58 процентов от уровней MeCP2 в нейронах дикого типа. Эти значения были сопоставимы с уровнями белка, достигнутыми в предыдущих исследованиях на моделях синдрома Ретта. Далее ученые заразили инженерной токсоплазмой первичные нейроны мышей и клетки нейробластомы мышей, и продемонстрировали, что GRA16-MeCP2 связывает гетерохроматин в ядрах, подобно функциональному эндогенному MeCP2. Также с помощью анализа pull-down ученые показали, что GRA16-MeCP2, доставляемый T. gondii, специфически связывает метилированную ДНК, подобно эндогенному человеческому MeCP2.

На органоидах коры мозга человека исследователи показали, что доставка белка GRA16-MeCP2 с помощью токсоплазмы меняет транскриптомные профили нейронов, хотя и не очень сильно. В нейронах, инфицированных T. gondii, несущей GRA16-MeCP2, слегка усилилась регуляция гена CREB1 и снизилась регуляция MEF2C. В заключение авторы сконструировали новые линии T. gondii, используя штамм с низкой вирулентностью, и ввели их мышам внутрибрюшинно. Последующий анализ срезов мозга этих мышей подтвердил локализацию GRA16-MeCP2 в ядрах нейронов. Дополнительно ученые заразили других мышей токсоплазмой, экспрессирующей токсофилин-Cre и GRA16-Cre, и показали, что токсофилин-Cre был доставлен в существенно больший объем нейронов. Белки, секретируемые как роптриями, так и плотными гранулами, локализовались преимущественно в коре головного мозга, а затем — в гиппокампе, стволе, гипоталамусе и таламусе.

Результаты работы, как отмечают авторы, показывают, что T. gondii можно использовать для доставки белков в клетки в исследовательских и терапевтических целях. Однако эту систему доставки еще предстоит улучшить. В частности, необходимо будет разработать новые ослабленные штаммы T. gondii, чтобы обеспечить безопасность векторов на основе токсоплазмы.

Недавно исследователи попробовали доставлять геннотерапевтические препараты в клетки в форме пены, а не привычной суспензии. В экспериментах на культурах клеток и мышах она обеспечивала в три раза более высокий уровень трансфекции.