В Китае успешно клонировали макака-резуса

Китайские исследователи усовершенствовали технологию переноса ядер соматических клеток и успешно применили ее для клонирования макака-резуса (Macaca mulatta). Ранее получить жизнеспособную обезьяну этого вида путем клонирования не удавалось, однако теперь три клона прожили больше двух лет. Отчет о работе опубликован в журнале Nature Communications.

Технология переноса ядер соматических клеток (SCNT) широко используется для клонирования различных видов млекопитающих: мышей, кроликов, свиней, крупного и мелкого рогатого скота, свиней и собак. При этом эффективность подобного подхода крайне низка — он приводит к рождению живого животного лишь в 1–3 процентах случаев (5–20 процентов у крупного скота) и часто сопровождается аномалиями развития.

Чжэнь Лю (Zhen Liu) и Цян Сунь (Qiang Sun) с коллегами по Институту нейронаук Китайской академии наук оптимизировали протокол SCNT, применили эпигенетические регуляторы и таким способом сумели клонировать обычных и генно-модифицированных макаков-крабоедов (Macaca fascicularis) в 2018–2019 годах. Использование деметилазы гистонов Kdm4d и ингибитора деацетилирования гистонов трихостатина А (TSA) в этих экспериментах позволило достичь уровней живорождения 2,5 и 1,5 процента соответственно. Клонирование макаков-резусов оказалось сложнее: хотя сообщения о подобных попытках впервые появились еще в 1997 году, жизнеспособных особей получить не удавалось. Единственный клон обезьяны этого вида, родившийся живым путем кесарева сечения, прожил лишь 12 часов и умер из-за мультиорганной дисплазии в результате внутриматочной аноксии — типичной проблемы, связанной с дефектами развития плаценты при SCNT.

В очередной серии экспериментов по SCNT резусов команда Лю и Суня использовала Kdm4d и TSA. Уровень формирования бластоцист (47,6 процента) оказался сопоставим с контрольной группой, в которой проводили оплодотворение интрацитоплазматической инъекцией сперматозоидов (ICSI, ИКСИ). При этом частота имплантации клонов была вдвое ниже (35 из 484 против 74 из 499), живым родился только один из них и прожил 23 часа. При этом большинство выкидышей при SCNT происходило около 60 дня, а при ИКСИ — 130 дня беременности. В сумме это свидетельствует о том, что основные проблемы у клонов манифестируют в стадии имплантации и периимплантации.

Молекулярные анализы показали, что у эмбрионов после ИКСИ и SCNT значительно различается уровень и паттерны метилирования ДНК. При этом эпигенетическое перепрограммирование при ИКСИ происходит упорядоченно и раздельно еще в родительских геномах, а при SCNT соматические эпигенетические модификации могут персистировать до стадии бластоцисты несмотря на общее деметилирование ДНК Kdm4d и TSA, что и приводит к большому числу дифференциально гипо- и гиперметилированных участков в ДНК клонированных эмбрионов.

Также у клонированных бластоцист наблюдался аберрантный материнский импринтинг четырех генов — THAP3, DNMT1, SIAH1 и RHOBTB3. Из них были подтверждены как дифференциально экспрессируемые гены с нормализованным показателем уровня экспрессии (FPKM) больше единицы. Такая утрата импринтинга наблюдалась и в постимплантационных эмбрионах, культивируемых in vitro на 17-й день после фертилизации, и в тканях сформированной плаценты, причем общий уровень метилирования ДНК в них был существенно выше, чем при ИКСИ. Ультразвуковое, морфологическое и гистологическое исследования плацент выявили их гиперплазию и кальцификацию при SCNT, которых при ИКСИ не наблюдалось.

Предыдущие эксперименты с мышами, кроликами, свиньями и коровами показали, что тетраплоидная комплементация может уменьшить недостаточность плаценты и повысить уровень живорождения при SCNT. Авторы работы создали тетраплоидные эмбрионы макаков-резусов методом электрослияния на стадии двух клеток и на стадии бластоцисты пронаблюдали у них формирование внутренней клеточной массы (эмбриобласта). 49 таких эмбрионов перенесли 16 самкам, что привело к развитию восьми беременностей с 16 имплантациями. Из этих 16 имплантированных эмбрионов половина развилась только в плодное яйцо, из остальных сформировались плоды. Три из них родились, один умер через год, остальные двое оставались живы на момент написания статьи (через два года наблюдения). Число хромосом у них было нормальным.

Учитывая ограниченную успешность тетраплоидной комплементации у обезьяньих эмбрионов, исследователи разработали технологию замены трофобласта (SCNT-TR, somatic cell nuclear transfer with trophoblast replacement). Для этого они брали бластоцисты, полученные методом ИКСИ, удаляли у них эмбриобласт, оставляя бластоцеле (трофобласт с полостью) и заменяли его эмбриобластом из SCNT-бластоцист. Эту технологию дополняли применением Kdm4d и TSA. 11 таких эмбрионов перенесли семи самкам, две из них забеременели, причем одна — близнецами. У последней случился выкидыш на 106-й день гестации. Одноплодная беременность завершилась рождением здорового самца на 157-й день, на момент написания статьи он жил значительно больше двух лет. Его ядерный геном был полностью унаследован от донора фибробластов, а митохондриальный — от донора яйцеклетки. Химеризма у него не наблюдалось. Дополнительное изучение плацент показало, что SCNT-TR предотвращает дифференциальное метилирование ДНК, дефекты инбридинга, гиперплазию и кальцификацию, то есть эта технология значительно совершенствует все аспекты клонирования обезьян.

В 2023 году та же научная группа сообщила о других достижениях. Во-первых, китайские исследователи собрали из стволовых клеток зародыши макака-крабоеда, дорастили их до 17 дня развития, и они даже имплантировались в матку суррогатных матерей, но дальше развиваться не стали. Во-вторых, ученым удалось получить клон обезьяны того же вида с 90 процентами химерных клеток.