Клоны флуоресцирующей макаки помогли оценить безопасность точечного редактирования генома
Китайские исследователи применили метод редактирования оснований ABEmax для выключения флуоресцентного белка у клонов генно-модифицированного макака-резуса. Использовав собственный подход, они проанализировали количество возникших при этом нецелевых мутаций и пришли к выводу, что в ДНК их практически нет, но в матричной РНК — множество. Хотя эффект этого временный, его необходимо учитывать при внедрении технологии в клиническую практику. Результаты работы опубликованы в журнале Science Advances.
Генетический код человека записан в ДНК четырьмя «буквами» — азотистыми основаниями: пуриновыми аденином (А), гуанином (Г), пиримидиновыми тимином (Т) и цитозином (Ц), которые спарены в двух цепочках ДНК парами А–Т и Г–Ц по принципу комплементарности. Точечные мутации, затрагивающие единственное азотистое основание, составляют более половины известных генетических вариантов, связанных с заболеваниями.
Для их коррекции в 2016 году на основе CRISPR/Cas9 (которая плохо подходит для этих целей из-за большого числа ошибок — инсерций и делеций) была разработана технология редактирования оснований (base editing). Она также прицельно ищет заданный участок генома с помощью направляющей РНК, но, в отличие от материнской методики, разрезает не обе цепочки ДНК, а одну (для этого используется никазный вариант Cas9 или Cas13), подавая сигнал клеточным механизмам восстановления ДНК. На соответствующем участке нетронутой цепочки фермент деаминаза превращает аденин в инозин (adenine base editor, ABE) или цитозин в урацил (cytosine base editor, CBE), которые при репарации комплементарны цитозину или аденину соответственно. В итоге после репликации ДНК пара А–Т заменяется на Г–Ц (в случае ABE) или Ц–Г — на Т–А (в случае CBE), и искомая точечная мутация устраняется.
Заменить пуриновое основание на пиримидиновое и наоборот таким способом невозможно, но требующие этого мутации встречаются реже.
В различных экспериментах редактирование оснований успешно избавляло мышей и обезьян от обусловленных точечными мутациями заболеваний, обнадеживающие результаты были получены и в опытах на человеческих эмбрионах. Тем не менее в ходе дальнейшей разработки технологии появились данные о том, что она может вызывать нецелевые (вне искомой последовательности нуклеотидов) мутации как ДНК, так и матричной РНК.
Чтобы уточнить степень подобного риска, сотрудники Куньминского научно-технологического университета и Юньнаньской ключевой лаборатории биомедицинских исследований приматов под руководством Юйюй Ню (Yuyu Niu) использовали оптимизированную технологию ABEmax для выключения экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) у трансгенных обезьян.
На предварительном этапе исследователи проверили принципиальную пригодность ABEmax для сайт-специфичной замены А–Т на Г–Ц в гене GFP на культуре клеток линии 293T. Эффективность редактирования в заданной позиции A4 составила 40 процентов, в пяти процентах наблюдалась нецелевая мутация по A9.
Материалом для создания обезьяньих клонов послужили фибробласты кожи генетически модифицированного 12-летнего макака-резуса, вырабатывающего GFP (и в силу этого светящегося в ультрафиолетовых лучах). Их ядра переносили в донорские яйцеклетки с удаленным собственным ядром и запускали их деление для развития SCNT-эмбрионов, экспрессирующих флуоресцентный белок.
На стадии одной клетки в эмбрионы микроинъекционно вводили матричную РНК ABEmax и направляющую РНК GFP. Целевая мутация по A4 возникла у 80 процентов из них (причем у 37,5 процента она была гомозиготной) с частотой от 17 до 100 процентов. У 12,5 процента также наблюдалась сопутствующая мутация по A9.
После этого исследователи перенесли для вынашивания 68 обычных ГМ-клонов 18 макакам и 154 отредактированных ABEmax — 31 макаке. Беременность наступила в трех случаях в первой группе и в пяти — во второй. До родов путем кесарева сечения дожила лишь одна отредактированная ГМ-обезьяна (в остальных случаях произошел выкидыш), но и она умерла спустя 12 часов. Вскрытие показало, что причиной смерти стала мультиорганная дисплазия в результате внутриматочной аноксии плода. Как пишут авторы, ее развитие с наибольшей вероятностью связано с недостатками технологии переноса ядер соматических клеток (в частности, неизученными эпигенетическими препятствиями в постимплантационном периоде), а не с применением технологии ABEmax. GFP новорожденное животное не вырабатывало и под ультрафиолетом не светилось.
Для поиска нецелевых мутаций ДНК выполнили полногеномное секвенирование образцов 11 бластоцист и тканей единственного животного, отредактированных ABEmax, 11 обычных SCNT-бластоцист и референсных клеток обезьяны-донора. В поиске однонуклеотидных вариантов (SNV) задействовали четыре разных программных алгоритма. Выяснилось, что среднее количество SNV (125 против 84, р = 0,87) и небольших инсерций-делеций (43 против 48, р = 0,19) в основной и контрольной группах значимо не различается.
Затем исследователи провели полнотранскриптомное исследование отредактированных и обычных SCNT-бластоцист, регистрируя SNV РНК с помощью аналитической системы Genome Analysis Toolkit (GATK) и тех же методов, что и в случае с ДНК. В основной группе в среднем оказалось значительно больше нецелевых замен аденина на гуанин, чем в контрольной группе (7888 против 2297, р = 0,0079). Подобные SNV наблюдались по всему транскриптому, причем 35 процентов из них затрагивали экзонные последовательности, то есть транслировались на белки. Что интересно, общий уровень экспрессии генов значимо не различался при использовании ABEmax и без него, при этом нецелевому редактированию гораздо чаще подвергались высокоэкспрессируемые гены.
Как пишут авторы работы, полученные результаты имеют практическое значение как в лабораторных, так и в клинических условиях. Хотя отредактированные молекулы РНК существуют недолго, влияние нецелевых мутаций транскриптома необходимо минимизировать перед терапевтическим применением технологии у людей.
Исследователи также отметили, что разработанный ими подход, названный «анализ нецелевых мутаций путем переноса ядер соматических клеток» (off-target analysis by somatic cell nuclear transfer, OA-SCNT) более точен и лучше подходит для исследований in vivo у приматов, чем созданный ранее метод полногеномного анализа нецелевых мутаций путем инъекции в двухклеточные эмбрионы (genome-wide off-target analysis by two-cell embryo injection, GOTI).
Несмотря на то, что полученные результаты неидеальны, они многократно превосходят по эффективности и безопасности устранения точечных мутаций классическую CRISPR/Cas9. Используемый в редактировании оснований никазный вариант Cas9, обычно обозначаемый dCas9 или nCas9, находит и другие применения. К примеру, если вместо деаминазы соединить его с РНКазой, можно предотвращать накопление транскриптов «паразитной» РНК, лежащее в основе таких тяжелых заболеваний как боковой амиотрофический склероз, миотоническая дистрофия мышц, болезнь Хантигтона и другие.
Олег Лищук
Эти эффекты зависели от пола
Американские исследователи выяснили, что прием каннабидиола беременными мышами связан с нарушениями термической болевой чувствительности, способности к решению задач и возбудимости префронтальной коры мозга у их потомства, причем эти эффекты зависят от пола. Отчет о работе опубликован в журнале Molecular Psychiatry. В странах, где препараты конопли разрешены для медицинского или рекреационного применения, некоторые беременные женщины принимают каннабидиол (второй по количеству каннабиноид после тетрагидроканнабинола) в чистом виде или в составе медицинской марихуаны для борьбы с тошнотой, считая, что это безопасно. При этом каннабидиол, не обладающий психоактивными свойствами, проникает через гематоплацентарный барьер и связывается с многими рецепторами, принимающими участие в развитии мозга, в том числе серотониновыми 5-HT1A, термочувствительными ваниллоидными TRPV1 и калиевыми каналами Kv7. Возможные последствия этого для потомства остаются малоизученными. Чтобы разобраться в этом вопросе, сотрудники из Университета Колорадо под руководством Эмили Энн Бейтс (Emily Anne Bates) вводили внутрижелудочно мышам с пятого дня беременности (примерно конец первого триместра) до родов 50 миллиграмм каннабидиола (высокая доза) в подсолнечном масле на килограмм массы тела ежедневно. Животные из контрольной группы получали только подсолнечное масло. На продолжительность беременности, набор массы тела в течение нее, размер и пол помета прием препарата не влиял. Он и его метаболиты полностью вывелись из плазмы мышат на восьмой день от рождения. Подошвенный тест на аппарате Харгиривза в возрасте 11 недель показал, что после внутриутробного воздействия каннабидиола у потомства мужского, но не женского пола значительно (p = 4,99 × 10-8) понижен порог термической болевой чувствительности. При нокауте гена TRPV1 он не изменялся, а значит, эффект связан именно с этими рецепторами. По данным тестов с темно-светлой камерой и различными лабиринтами, прием каннабидиола во время беременности не влиял на уровень тревожности, компульсивность и пространственную память потомства. В экспериментах с клетками-головоломками выяснилось, что после такого воздействия самки, но не самцы медленнее (p = 0,02) справляются с решением задач, что, вероятно, связано с гиперактивацией 5-HT1A-рецепторов. Электрофизиологическое исследование в возрасте 14–21 дня показало, что у таких самок повышен (p = 0,00007) порог запуска потенциала действия (то есть снижена возбудимость) Kv7-положительных пирамидных нейронов слоя 2/3 префронтальной коры, отвечающей за обучение и исполнительные функции. Плотность, размеры и морфология дендритных шипиков этих клеток затронуты не были, однако амплитуда возбуждающих потенциалов, вызванных активацией глутаматных AMPA-рецепторов, оказалась существенно снижена (p = 0,0009). У самцов подобных изменений не наблюдалось. Полученные данные свидетельствуют о том, что ежедневный прием высоких доз каннабидиола на протяжении последних двух триместров беременности мышами вызывает изменения физиологии нейронов и развития нервной системы у потомства, что в дальнейшем проявляется сенсорными и поведенческими расстройствами, причем эти эффекты зависят от пола животных. Авторы работы намерены уточнить, как на них влияют доза препарата и его прием в отдельные периоды беременности. В 2022 году канадские исследователи сообщили, что около двух процентов их беременных соотечественниц употребляют марихуану, причем это коррелирует с повышенным риском преждевременных родов, низкой массы ребенка при рождении, недостаточным или избыточным весом для гестационного возраста, любых врожденных аномалий, кесарева сечения и гестационного диабета.
