Нейроны человека реагировали еще и на ориентацию линий
Выращенные из стволовых клеток человека мозговые органоиды, пересаженные в мозг взрослых крыс с поврежденной зрительной корой, проявили активность, когда крысы увидели мигающие огни и чередующиеся черные и белые линии. На основании этого исследователи заключили, что человеческие нейроны взяли на себя некоторые функции зрительной системы крыс, говорится в статье, опубликованной в журнале Cell Stem Cell. Ее авторы полагают, что выращенные из стволовых клеток человека ткани можно будет использовать для восстановления поврежденных участков мозга взрослых животных и, в перспективе, возможно, людей.
Травмы и болезни головного мозга могут приводить к обширным повреждениям нервной ткани и утрате некоторых функций. Это могут быть, например, потеря чувствительности, двигательных навыков разной степени тяжести (парезы и параличи), нарушения речи и слуха. И так как нейрогенез у взрослых млекопитающих ограничен, то самостоятельно поврежденные регионы восстановиться не могут.
Этому может помочь трансплантация тканей в пораженные участки. Например, успешно проводилась пересадка участков лобной коры от плода грызунов к взрослым животным с моторными нарушениями: эти клетки приживались и встраивались в системы мозга, а у взрослых животных улучшались моторные навыки. Но проводить подобные процедуры с людьми невозможно по этическим соображениям.
Зато можно вырастить крохотную модель мозга из плюрипотентных стволовых клеток человека и уже пересаживать таким образом полученные ткани. Несмотря на то, что такие мини-мозги весьма малы (обычно с горошину), они во многом схожи с настоящими по структуре и электрической активности, а некоторые еще и отращивают себе зачатки глаз. Кстати, на сегодняшний день ученые не только успешно создают мини-мозги современного человека, но и, например, делают это из клеток, в ДНК которых внесена мутация, характерная для неандертальского генома.
Ранее американские исследователи успешно пересадили новорожденным крысятам органоид мозга человека. В виду того, что в этом возрасте развитие мозга у животных еще не завершилось, пересаженные ткани прижились и встроились в структуру мозга крысят. За время наблюдения ученые отметили значительное увеличение объема пересаженных структур, образование внутри них сосудов и клеток микроглии — одного из типов иммунных клеток в головном мозге.
При этом повреждение нервных тканей головного мозга переживают не только новорожденнные, но и взрослые. Поэтому эксперименты с удачной пересадкой органоидов мозга взрослым животным сейчас необходимы, однако до недавнего времени их не было.
Теперь Айзек Чен (Isaac Chen) из Пенсильванского университета и его коллеги пересадили органоиды мозга человека в зрительную кору молодых взрослых самцов крыс, предварительно удалив (то есть повредив) часть зрительной коры животных.
До того, как органоид мозга был имплантирован в мозг животных, его выращивали в течение 80-88 суток. Чтобы после пересадки отличать органоиды мозга человека от собственных тканей крыс, ученые выращивали мини-мозги из плюрипотентных стволовых клеток, которые экспрессировали зеленый флуоресцентный белок.
Также до пересадки и каждый день после иммунитет крыс подавлялся с помощью инъекций циклоспорина А, — чтобы иммунная система не атаковала органоиды, и они могли прижиться. За результатами проведенной операции исследователи наблюдали в течение трех месяцев, после крыс умерщвили.
В результате оказалось, что мозговые органоиды прижились в мозгу крыс. Внутри них появились сосуды, и сосудистая сетка увеличилась за месяцы наблюдения (p < 0,001). Более того, между органоидом и разными отделами мозга крыс образовались нейронные связи, при этом структура и состав органоида соответствовали строению зрительной коры, но человеческой, и миграции нейронов крысы в органоид ученые не обнаружили. Также исследователи отметили увеличение объема органоида в течение времени, хотя и незначительное.
Далее необходимо было выяснить, реагируют ли прижившиеся нейроны органоида на зрительные стимулы. Для этого исследователи ввели в имплантированный органоид 32 внутрикортикальных электрода. Эти электроды записывали ЭЭГ восьми крыс, пока животные смотрели на экран с мигающими огнями. Для сравнения ученые сняли ЭЭГ у двух крыс, которым не проводили пересадку органоида мозга человека (для удобства далее будем называть их «наивными»).
Через два месяца органоидные нейроны шести крыс начали демонстрировать электрическую активность в ответ на мигающие огни. Хотя, реакции органоидных нейронов и собственных нейронов зрительной коры наивных животных несколько отличались: реакция органоидных нейронов была более продолжительной, но при этом возникающие в них связанные с событием потенциалы имели меньшую амплитуду, и, наконец, меньшее число органоидных нейронов откликались в ответ на зрительный стимул (p = 0,005).
Также исследователи показали крысам чередующиеся черные и белые линии разной ориентации, например, горизонтальные и диагональные, — это помогло ученым понять, могут ли пересаженные нейроны кодировать особенности зрительной информации. Через два месяца органоидные нейроны демонстрировали избирательность ориентации, подобную той, что наблюдалась в собственных нейронах зрительной коры наивных крыс (р = 0,649).
Как считают авторы, результаты их исследования показывают, что человеческие нейроны интегрировались в мозг крыс и взяли на себя некоторые функции зрительной системы этих животных.
В будущем исследователи планируют пересадить человеческие органоиды и в другие области мозга животных, например, в моторные отделы, а в несколько отдаленной перспективе — провести подобные операции и с людьми, у которых есть повреждения корковых структур. Таким образом, подобный способ можно будет применять при реабилитации людей, перенесших травмы головного мозга, инсульт или другие состояния, повлекшие повреждения корковых структур.
Однако не только пересадка выращенных из стволовых клеток тканей может помочь при реабилитации людей с поражениями мозга, но и введение в мозг непосредственно стволовых клеток. Таким образом поступили ученые из Стэнфорда: они ввели в мозг парализованных после инсульта людей мезенхимальные стволовые клетки из костного мозга доноров. В результате этой процедуры часть пациентов начала лучше говорить и двигаться, а некоторые снова смогли ходить.
Могут ли астроциты передавать нервный импульс
Недавно в журнале Nature вышла статья: ученые из Италии и Швейцарии рассказали, что нашли в мозге взрослых мышей астроциты, которые выделяют нейромедиатор глутамат подобно нейронам. Когда этим астроцитам мешали выделять глутамат, у мышей нарушалась память и усиливались приступы эпилепсии. Получилось, что астроцитарный глутамат напрямую влиял на синаптическую передачу. То есть не только нейроны участвуют в передаче нервного импульса? А если так, то астроциты могут быть причиной болезней — и, соответственно, мишенью для терапии? Это что-то новое? Долгое время считалось, что выделять нейромедиаторы умеют только нейроны. Концы их отростков образуют синапсы — особые межклеточные контакты, где выделенный одним нейроном нейромедиатор воздействует на рецепторы другого и вызывает в нем электрический импульс. Так сигналы поступают от одного нейрона к другому и циркулируют внутри нервной системы. Другие клетки тоже обмениваются сигналами — например передают друг другу ионы и небольшие молекулы через свои межклеточные контакты. Но нервный импульс передают только нейроны. И при функциональных или когнитивных неполадках поломку первым делом ищут в них. В мозге, конечно, много клеток помимо нейронов — в основном [note=3170|глиальных]. Например, астроциты — глиальные клетки с кучей отростков, которые окружают нейроны и синапсы. Раньше считалось, что они выполняют только вспомогательные функции: поставляют нейронам питательные вещества и служат им физической опорой. Но в конце прошлого века ученые выяснили, что астроциты участвуют в формировании синапсов и регулируют синаптическую передачу. В частности, чтобы остановить сигнал, эти клетки поглощают лишний глутамат, который выделили нейроны. А если отделить нейроны от астроцитов и других глиальных клеток, передача сигналов между нейронами нарушается. То есть стало ясно, что синаптическая передача зависит от астроцитов — хотя как полноценных участников процесса их никто не рассматривал. Трехсторонний синапс Позже у астроцитов обнаружили и другие свойства. В 1995 году ученые нашли (1, 2) в астроцитах рецепторы глутамата mGluR5. Такие рецепторы есть и в нейронах — они, согласно названию, реагируют на глутамат. Когда глутамат связывается с рецепторами, в цитоплазме клетки повышается концентрация ионов кальция. Кальций — главный ион, участвующий в возбуждении нейронов и передаче нервного импульса. Он может поступать в клетку через кальциевые каналы наружной мембраны или высвобождаться из эндоплазматического ретикулума непосредственно внутри клетки. Когда концентрация ионов кальция в нейроне увеличивается, выделяется нейромедиатор. В экспериментах глутамат активировал эти рецепторы в астроцитах, и в них тоже повышался уровень кальция — как в нейронах. Еще позже выяснилось, что в результате астроциты высвобождают различные активные вещества: тот же глутамат, а еще — АТФ и D-серин (эти молекулы тоже могут играть роль нейромедиаторов). Выделение астроцитами нейромедиаторов назвали глиотрансмиссией — по аналогии с нейротрансмиссией, где передатчик — нейрон. Когда ученые стимулировали один астроцит, волны кальция распространялись и среди соседних — что подтверждало передачу сигнала между глиальными клетками. Обнаружив, что астроциты тоже могут и выделять [note=3171|нейромедиаторные молекулы], и реагировать на них, ученые предложили концепцию «трехстороннего синапса», где астроцит стал третьим участником синаптической передачи. Исследователи стали повторять прошлые эксперименты и придумывать новые — нужно было убедиться, что астроцит действительно может работать «почти как нейрон», а сам нейрон — реагировать на глиотрансмиттеры, выделяемые астроцитом. Чтобы доказать, что клетка может выделять нейромедиатор, недостаточно обнаружить в ней кальциевую активность. Еще не обойтись без везикул — мембранных пузырьков, в которых молекула-нейромедиатор перемещается из клетки наружу. И в 2004 году в выделенных из зрительной коры мозга крыс астроцитах нашли белок-транспортер VGLUT, который переносит глутамат в такие пузырьки. А в 2012 году в астроцитах крысиного мозга обнаружили синаптические микровезикулы, в которых глутамат накапливается почти в тех же концентрациях, что и в синаптических пузырьках нейронов: 45 миллимоль на литр в астроцитах и 55 миллимоль на литр — в нейронах. Появились и доказательства, что выделяемый астроцитами глутамат влияет на нейроны. Ученые стимулировали астроциты, и, когда те выделяли нейромедиатор, вероятность, что соседние нейроны его выделят в ответ, увеличивалась. А еще астроцитарный глутамат вызывал возбуждение нейронов, которое сохранялось, даже когда синаптическая активность была заблокирована. Все выглядело так, будто астроцит — действительно полноправный участник синаптической передачи, а концепция трехстороннего синапса находила все больше сторонников. Доверяй, но проверяй С доказательствами появились и сомнения. Некоторые ученые предположили, что астроциты, которые высвобождают глутамат в лабораториях, могут не делать этого в физиологических условиях. Или что этот глутамат не так уж сильно влияет на синаптическую активность в живом мозге. Большинство исследований проводилось in vitro или in situ — на выделенных или культивированных клетках или на срезах ткани мозга. А для стимуляции часто применялись вещества, которые активируют рецепторы и в астроцитах, и в нейронах, — и тогда сложно было доказать, что на нейронную активность влияет именно астроцитарный глутамат. Исследователи стали искать методы, во-первых, более избирательные, а во-вторых, способные имитировать естественные процессы. В 2007 году ученые из Университета Северной Каролины создали трансгенных мышей, которые экспрессируют в астроцитах искусственный рецептор Gq-GPCR. Активация этого рецептора повышала уровень кальция в клетке по аналогии с активацией рецепторов глутамата. Но глиотрансмиссию ученые не обнаружили, как и изменений в синаптической активности и пластичности. Иными словами, повышение уровня кальция в одних только астроцитах не вызвало никаких дополнительных эффектов. Семь лет спустя эта же группа провела эксперимент, в котором из астроцитов мышей удалили нативный рецептор IP3R2 — один из тех, которые отвечают за повышение концентрации кальция в клетке. Это частично лишило астроциты кальциевой активности и глиотрансмиссии, но никаких поведенческих аномалий у таких животных не было. Авторы пришли к выводу, что синаптическая передача нарушена не была. Еще раньше опровергли историю с D-серином (еще одним предполагаемым глиотрансмиттером): более точные методы показали, что его в основном выделяют сами нейроны. А поскольку доказательства того, что астроциты выделяют глутамат, были получены с использованием тех же подходов, то и они явно требовали перепроверки. Кроме того, исследователи заметили, что в здоровых мышиных астроцитах не всегда удается наблюдать волны кальция, необходимые для высвобождения глутамата. А в 2013 году поискали рецепторы глутамата в астроцитах взрослых и молодых мышей — и нашли их только в молодых клетках. Оказалось, что после третьей недели астроциты перестают экспрессировать гены рецепторов. В астроцитах взрослого человеческого мозга экспрессию рецепторов глутамата тоже не обнаружили. В более позднем исследовании транскриптома и протеома зрелых мышиных астроцитов ученые даже не нашли в них везикул или хотя бы необходимого количества РНК везикулярных транспортеров глутамата. Тогда ученые предположили, что трехсторонний синапс работает только в развивающемся мозге, и снова отказали астроцитам в самостоятельности, пока оставив их в роли вспомогательных клеток. Третий не лишний Разрешить возникший спор о том, способны ли все-таки астроциты во взрослом мозге выделять глутамат, взялся Андреа Вольтерра (Andrea Volterra) из Лозаннского университета. Вольтерра был одним из первых исследователей, кто в конце прошлого века показал, как активация рецепторов глутамата в астроцитах приводит к глиотрансмиссии. Теперь с коллегами из Италии и Швейцарии он обратился к базам данных секвенирования РНК единичных клеток гиппокампа мышей. Они идентифицировали в гиппокампе девять разных кластеров астроцитов. Один кластер избирательно экспрессировал гены, необходимые для зависимого от кальция высвобождения глутамата, — в том числе ген Slc17a7, кодирующий VGLUT1 (тот самый белок-транспортер). Ученые визуализировали эту субпопуляцию в срезах гиппокампа взрослых мышей и увидели, что астроциты действительно экспрессируют гены, необходимые для высвобождения глутамата. Чтобы убедиться, что клетки субпопуляции в самом деле высвобождают глутамат, ученые встроили в них [note=3172|рецепторы, реагирующие только на синтетические препараты]. Если в результате активации этих рецепторов выделялся глутамат, ученые наблюдали флуоресценцию. Чтобы удостовериться, что это не тот глутамат, который выделяют нейроны, срезы обработали синаптическими блокаторами, действующими прицельно на нейроны. В результате в ответ на стимуляцию рецепторов во всех визуализированных астроцитах увеличивался уровень кальция, но глутамат выделяла только треть клеток — это и была та самая субпопуляция. Когда ученые стимулировали нативные рецепторы астроцитов, они видели то же самое: высвобождение глутамата происходило не во всех клетках. Если ген нативного рецептора удаляли, астроциты больше не реагировали на стимуляцию. Они переставали выделять глутамат и в том случае, когда ученые выключали везикулярный транспортер глутамата VGLUT1 — то есть мешали везикулам заполниться нейромедиатором. Затем авторы перешли к экспериментам на бодрствующих трансгенных мышах. Если астроцитам мешали выделять глутамат, интенсивность синаптической передачи снижалась, а у мышей ухудшалась память: спустя сутки они хуже помнили неприятный стимул. Кроме того, при отключении глиотрансмиссии у грызунов усиливались эпилептические приступы, которые ученые вызывали с помощью препаратов. Общая продолжительность приступов была такой же, как у контрольных животных, но отдельных эпизодов (внутри каждого приступа) у мышей с выключенным геном было больше, и они были длиннее, а промежутки между ними — короче. То есть глиотрансмиссионный путь передачи импульса если и не критичен для работы мозга, то точно важен. Наконец, ученые проверили, есть ли такие же астроциты и в других частях мозга. Для этого они изучили нейронную цепь, которая соединяет черную субстанцию с дорсальным полосатым телом. Эта цепь контролирует произвольные движения, а ее дегенерацию наблюдают при болезни Паркинсона. Астроциты этой области экспрессировали в основном другой транспортер глутамата — VGLUT2. Когда ген этого белка удалили, глутамат из астроцитов выделяться перестал, а нейроны рядом стали гиперактивны. Тогда исследователи попробовали простимулировать рецепторы глутамата на самих нейронах (глиотрансмиссии все еще не было) — и активность нейронов пришла в норму. А когда рецепторы на нейронах, наоборот, заблокировали, клетки возбуждались еще сильнее. Авторы пришли к выводу, что именно глиотрансмиссия не дает нейронам этой цепи гиперактивироваться — то есть глутамат, выделенный астроцитами, связывается с рецепторами нейронов и снижает их возбуждение. Получается, в мозге мышей действительно есть астроциты, высвобождающие глутамат. Это высвобождение зависит от уровня кальция в клетке и влияет на нейронную активность в норме и при патологии. Проанализировав базы данных секвенирования РНК человеческих астроцитов, авторы нашли глутаматергические астроциты и у них, но эксперименты пока не ставили. Что теперь? Вольтерра с коллегами доказали, что глиотрансмиссия есть даже во взрослом мозге мышей. Значит, трехсторонний синапс работает. Правда выделять глутамат способны не все астроциты, а лишь определенная субпопуляция, экспрессирующая все нужные для этого гены. Скорее всего, именно поэтому в предыдущих исследованиях глиотрансмиссию обнаруживали не всегда. То, что глиотрансмиссия влияет на нейропередачу, тоже удалось доказать. Глутамат астроцитов может помогать нейронам возбуждаться — и таким образом поддерживать работу памяти, а может — тормозить активность нейронов и так снижать интенсивность приступов эпилепсии. Пока непонятно, почему возбуждающий нейромедиатор — еще и в малых количествах — способен так по-разному влиять на нейроны. Также неизвестно, как распределены глутаматергические астроциты по мозгу и насколько ощутимо влияние глиотрансмиссии на работу мозга и поведение. Возможно, в будущем глутаматергические астроциты смогут стать терапевтической мишенью и помогут нам лечить расстройства памяти (ведь не зря эти астроциты сосредоточены именно в гиппокампе), болезнь Паркинсона и эпилепсию. Но до тех пор многое предстоит выяснить. Пока понятно одно: некоторые астроциты могут передавать сигнал, подобный синаптическому. А значит, когда речь заходит о нарушениях синаптической передачи, не всегда виноваты нейроны.