Китайские ученые лишили мышей хромосомы. А потом еще одной

Китайские ученые опробовали новый метод геномной инженерии: они научились сшивать мышиные хромосомы между собой. Оказалось, что, если хромосомы не очень большие, то их несложно склеить и получить мышонка с нечетным количеством хромосом. Такие животные могут вырасти здоровыми и плодовитыми и скрещиваться с обычными лабораторными мышами. А в третьем поколении исследователям удалось получить мышонка без двух хромосом сразу — то есть с 19 парами вместо положенных 20. Работа опубликована в журнале Science.

У обычной лабораторной мыши 40 хромосом, то есть 20 пар. Это число не изменилось по меньшей мере за то время, что ученые над ними экспериментируют и разводят их в неволе. Тем не менее, известно, что изменение в числе хромосом не всегда смертельно. Например, у человека хромосом на две меньше, чем у гориллы (у нее 48) — по всей видимости, после расхождения наших с ними эволюционных путей две хромосомы слились в одну.

Группа ученых из Института Зоологии Китайской Академии Наук под руководством Вэя Ли (Wei Li) попробовала воспроизвести такое событие на мышах — то есть с помощью методов генной инженерии сшить друг с другом пару мышиных хромосом. Для этого им предстояло укоротить хромосомы с концов, поскольку с обеих сторон хромосомы заканчиваются теломерами. Кроме того, у мышей на одном из концов каждой хромосомы находится центромера — важная для деления структура, которая у большинства человеческих хромосом расположена в центре (мы рассказывали о них в тексте «Путешествие к центру генома»). Поэтому, чтобы приклеить одну хромосому к другой, нужно от обеих отрезать теломеру, а от одной еще и центромеру.

В качестве мишеней авторы эксперимента выбрали две пары: хромосомы 1 и 2 (самые большие в геноме мыши) и 4 и 5 (среднего размера). При этом 1 и 2 решили комбинировать двумя способами: в одном случае пожертвовать центромерой 1, а в другом — центромерой 2.

Исследователи работали с гаплоидными эмбриональными стволовыми клетками мыши. Методику получения таких линий они отработали раньше, когда создавали мышат от двух матерей и от двух отцов. Они брали мышиные яйцеклетки, удаляли из них ядро и оплодотворяли сперматозоидом, а дальше заставляли делиться. Получалась культура клеток с одиночным набором хромосом (то есть гаплоидная). В таких клетках гораздо удобнее заниматься геномной инженерией, потому что, в отличие от обычных клеток, не нужно стремиться попасть сразу в обе копии хромосом.

В этих гаплоидных клетках ученые использовали систему редактирования CRISPR/Cas9, натравив ее на центромеры и теломеры: она должна была внести разрезы по краям этих участков хромосом, тем самым «откусив» их целиком. Дальше, по задумке ученых, в клетках должна была заработать система репарации — белки, которые заделывают дыры в ДНК. Эти белки должны были обнаружить липкие концы хромосом и сшить их друг с другом. Чтобы проверить результат, исследователи покрасили получившиеся хромосомы — оказалось, что хромосомы 4 и 5 склеиваются хорошо, равно как и 2 с 1. А вот конструкция 1 + 2 не получилась: хромосома 1 развалилась на два куска, один из которых слипся с хромосомой 2, а второй — с хромосомой 17.

Дальше авторы эксперимента вырастили культуру из геномно-инженерных клеток. Для этого их приходилось сортировать и отбраковывать те, что спонтанно диплоидизировались, то есть обретали второй набор хромосом. При этом исследователи проверили, что клетки продолжают обладать свойствами эмбриональных стволовых: экспрессируют похожий набор генов и могут дифференцироваться в предшественники нервных клеток под действием сигнальных веществ.

Затем исследователи отобрали, наоборот, только клетки, которые диплоидизировались, и проверили, насколько у них работает механика клеточного деления. Оказалось, что с этой задачей хорошо справляются только клетки с гибридами 4 + 5 и 1 + 2 (с усеченной хромосомой 1). А вот гибрид 2 + 1 эту планку не преодолел — как заключили авторы работы, хромосома получилась слишком длинной и громоздкой и не вписывалась в отведенное ей место.

Наконец, ученые попробовали создать целых мышей с измененным набором хромосом. Для этого в гаплоидных клетках они удалили три участка генома с помощью той же CRISPR/Cas9 — это нужно, чтобы компенсировать отсутствие материнских хромосом (о том, как это работает и при чем тут импринтинг, мы рассказывали в материале «Половинка себя»). Потом слили эти клетки с яйцеклетками мыши, несущей зеленый флуоресцентный белок — чтобы потом можно было проверить, что материнские хромосомы в клетках остались. Получились эмбрионы с разными хромосомными гибридами, которые подсадили суррогатным матерям.

Мышата с гибридом 2 + 1 так и не дожили до рождения — в них возникало слишком много полиплоидных клеток (более чем с двумя наборами хромосом). Зато родилось 14 детенышей с гибридом 4 + 5 и 37 — с гибридом 1 + 2. В их клетках было 39 хромосом вместо сорока: в одном комплекте все 20 хромосом на своих местах, а во втором — две склеены в одну. Но аномальный геном не помешал им расти и развиваться: они родились с таким же весом, как и обычные мышата.

Правда, у гибридов 1 + 2 ученые обнаружили повышенный уровень тревожности по сравнению с гибридами 4 + 5 и обычными мышами (p < 0,001). Исследователи заподозрили, что дело в гене Capn11 — он находится на хромосоме 17 и мог повредиться при слиянии с участком хромосомы 1. Тогда его удалили у обычных мышей — и они тоже начали вести себя более тревожно.

Аномальный набор хромосом мог помешать мышам размножаться — поскольку при образовании половых клеток каждая хромосома должна встретить свой гомолог (то есть хромосому того же номера из второго набора). У гибридов 1 + 2 это не получилось: ни одна из 30 мышей не смогла дать потомство. А вот гибриды 4 + 5 справились с этой задачей, хоть их плодовитость и была ниже среднего: у них родилось потомство от здоровых партнеров.

Среди мышат следующего поколения были те, у кого в одном комплекте 4 и 5 хромосомы были раздельными, а в другом — сшитыми. Таких мышат исследователи скрестили друг с другом — и получились мышата-внуки, среди которых были животные с двумя гибридными хромосомами 4 + 5. Всего у них было 19 пар хромосом, то есть на две меньше, чем обычно.

Таким образом, исследователи создали модель, на которой можно изучать, среди прочего, механизмы эволюции хромосомных наборов. Например, они уже выяснили, что при гибридизации хромосом важен размер — слишком большие хромосомы могут сливаться, но особи при этом не выживают. А хромосомы поменьше, наоборот, легко сшиваются, и это не обязательно приводит к неприятностям. Более того, даже одно событие гибридизации не производит к репродуктивной изоляции — и особи с одной слитной хромосомой продолжают успешно скрещиваться с носителями исходного хромосомного набора.

О том, как ученые создавали организмы с минимальным геномом и переписывали их ДНК, читайте в нашем тексте «С правом на переписку». А недавно удалось впервые собрать искусственный бактериофаг.

Полина Лосева