Созданы первые синтетические бактериофаги

Ученые из Португалии создали бактериофаги с укороченным геномом и описали их. Это первая успешная попытка создать синтетические бактериальные вирусы. Авторы надеются, что их исследование поможет при создании новых антибактериальных веществ. Работа опубликована в Scientific Reports.

Развивающаяся антибиотикоустойчивость во всем мире представляет собой одну из самых страшных угроз здоровью человечества. Она заставляет исследователей искать альтернативные терапевтические подходы. В том числе, ученые рассматривают использование бактериофагов — вирусов, которые заражают бактерии. Идея сама по себе не нова: использовать бактериофаги в качестве лекарств начинали еще в 1920-х, когда антибиотики еще не были доступны. С тех пор бактериофаги — как и природные, так и измененные генно-инженерными способами — использовались в качестве терапии (об одном из таких случаев редакция N + 1 рассказывала в прошлом году), но так и не стали полноценным заменителем антибиотиков. Ситуация складывается таким образом по многим причинам, и в том числе из-за недостаточной изученности многих фагов.

Геномы бактериофагов небольшие, однако и в них встречаются участки (довольно большие, до 80 процентов генома), функции которых ученым пока неизвестны. Есть некоторая вероятность, что белки, кодируемые неизвестными генами, могут быть вредными для человека. Кроме того, «целые» геномы неудобны для дальнейшего манипулирования, например, добавления необходимых для терапевтических целей генов. Удаление генов с неизвестными функциями позволило бы оставить только известные и безопасные гены и освободить место для новых.

Подобные опыты по минимизированию геномов уже проводились на живых объектах. Известность получили работы, выполненные под руководством биолога Крейга Вейнтера (J. Craig Venter) по созданию бактерии с минимальным геномом. Тогда ученые определили часть генов бактерии Mycoplasma mycoides как «не жизненно необходимые» и удалили их, получив, по сути, новый синтетический организм. Подробнее об этом направлении в синтетической биологии можно прочитать в материале «Прожиточный минимум».

В новой работе португальские ученые стремились создать синтетический бактериофаг, который поражал бы синегнойную палочку (Pseudomonas aeruginosa). На данный момент лечение вызванных Р. aeruginosa инфекций достаточно затруднено из-за высокой устойчивости этой бактерии ко многим антибиотикам. ВОЗ называет разработку средств против синегнойной палочки одной из приоритетных задач.

Исследователи из университета Минью под руководством Жуаны Азередо (Joana Azeredo) взяли за основу бактериофаг, поражающий Р. aeruginosa, который они выделили из сточных вод. Для начала ученые проверили природные способности этого фага (он получил название РЕ3). Из 28 полученных от пациентов образцов Р. aeruginosa, бактериофаг смог поразить семь. Исследователи получили изображения бактериофага при помощи просвечивающей электронной микроскопии, и провели секвенирование его генома. Выяснилось, что геном фага PE3 состоит из 43,5 тысяч нуклеотидных оснований двухцепочечной ДНК. Опираясь на результаты компьютерного анализа, исследователи предположили, что всего в геноме 55 кодирующих белки последовательностей. Авторы работы заключили, что описанный ими бактериофаг относится к семье Autographiviridae.

Далее ученые предположили, что из генома бактериофага PE3 можно вырезать два модуля генов, которые, вероятно, кодируют белки: с первого по пятый (gp1-gp5) и с шестого по двенадцатый (gp6-gp12). Авторы работы создали три варианта синтетического генома: в двух удалили по одному из модулей, и в третьем удалили оба. При помощи ПЦР исследователи амплифицировали оставшиеся гены и соединили их в клетках дрожжей в искусственную дрожжевую хромосому. Полученный синтетический геном бактериофага выделили из дрожжей и трансформировали ими бактерию-хозяина P. aeruginosa, чтобы проверить способность наследственной информации фага генома запустить программу сборки вирусных частиц. Эксперимент прошел успешно: на чашках с бактериями образовались видимые фаговые бляшки — места, где вирус повредил бактерии.

Чтобы лучше понять, как нокаут генов повлиял на бактериофаг, авторы работы сравнили его жизнеспособность с диким типом. Во-первых, фаговые бляшки уменьшились в размерах.

Во-вторых, не все синтетические бактериофаги смогли инфицировать те же штаммы синегнойной палочки, что и их предшественник. Только фаги с делецией модуля gp6-gp12 оказали значительный эффект на 7 из 28 клинических образцов P. aeruginosa, остальные инфицировали лишь 4 штамма. Кроме того, фаги с делецией gp6-gp12 демонстрировали темпы роста, схожие с РЕ3, в то время как фаги с делециями gp1-gp5 и gp1-gp12 отставали на пять и пятнадцать минут, соответственно.

В то же время, антибактериальная эффективность бактериофагов не пострадала от проведенных манипуляций. Это выяснилось в ходе in vitro экспериментов, где к бактериальным культурам, находящимся в экспоненциальной фазе роста, добавили бактериофаги. Соотношение вирусных частиц к клеткам составило 1:5. Все варианты фагов проявили одинаковую эффективность, значительных различий не наблюдалось ( р > 0,01). Спустя два часа после добавления фагов, количество живых клеток уменьшилось на пять порядков во всех образцах по сравнению с контрольной группой (р < 0,01). После этого, однако, количество живых клеток снова стало расти, и через 24 часа после начала эксперимента почти не отличалось от контрольной группы (р < 0,01). Это демонстрирует быстрое развитие нечувствительных к фагам мутантных бактерий.

Также исследователи протестировали терапевтическую эффективность синтетических бактериофагов in vivo на Большой восковой моли (G. mellonella). После инфицирования бактериями, насекомым ввели растворы с бактериофагами. Спустя 24, 48 и 72 часа выживаемость в контрольной группе составила, соответственно, 20, 13 и 10 процентов. Получившая лечение бактериофагами группа продемонстрировала лучшие результаты (р < 0,05): их выживаемость составила 50 процентов спустя 24 часа, и 30 процентов спустя двое и трое суток. При этом со своей задачей одинаково хорошо справились и синтетические бактериофаги, и их природный предшественник.

Ученые надеются, что методы синтетической биологии в дальнейшем позволят быстро разрабатывать и создавать специализированные бактериофаги ко многим бактериальным видам.

Бактериофаги и ранее уже помогали медикам: так, совместное применение фагов и антибиотиков спасло пациента от антибиотикоустойчивой инфекции Р. aeruginosa, а модифицированные фаги, возможно, вылечили инфекцию микоплазмой. Кроме того, австралийские ученые описали, как присутствие бактериофагов заставляет бактерию снова стать чувствительными к антибиотикам.

Вера Сысоева