За образованием гамет растений понаблюдали в реальном времени
Биологи смогли пронаблюдать в режиме реального времени формирование женского гаметофита резуховидки Arabidopsis thaliana. Для этого ученые культивировали семяпочки растения в пробирке, пометили клетки гаметофита флуоресцентными метками и проследили за судьбой отдельных клеток при помощи флуоресцентной микроскопии. Работа опубликована в PLoS Biology.
В многоклеточных организмах клетки разного типа сильно отличаются друг от друга. В каждой дифференцированной клетке – много свойственных только для нее структур, которые помогают клетке выполнять ее особые функции. Для организма важно, чтобы дифференциация каждой клетки произошла в нужное время и в нужном месте. Однако растительные молекулярные механизмы, которые помогают клетке определять ее местонахождение, пока еще не очень хорошо изучены. Процесс развития половых клеток в женских гаметофитах растения – привлекательная модель для изучения клеточной судьбы.
В женских гаметофитах покрытосеменных растений много клеток, сильно отличающихся по своим функциям. В модельном растении Arabidopsis thaliana, одна мегаспора проходит через три раунда митоза и образует семь клеток с восемью ядрами: одну яйцеклетку, одну центральную двухъядерную клетку, две клетки-спутницы (синергиды) и три клетки-антипода. Успешность полового размножения всего растения зависит от правильного развития этих клеток. Свойственные каждому типу этих клеток гены, которые экспрессируются во время дифференциации, уже установлены для некоторых растений, в том числе для Arabidopsis thaliana. Но для биологов оставалось непонятным, как и когда клетки решают, что пришло время для экспрессии этих генов и дифференциации. Исследования на мутантных растениях показывали, что существует сильная зависимость между позицией ядра в клетке и клеточной судьбой. Однако такая корреляция не обязательно означает, что положение ядра определяет судьбу клетки.
Поскольку развитие женского гаметофита происходит внутри пестика, оно скрыто от глаз наблюдателей, и исследовать его формирование ранее приходилось на фиксированных срезах.
Биологи из Нагойского и Йокогамского городского университетов под руководством Дайске Курихары (Daisuke Kurihara) разработали способ, который позволил им подглядеть за формированием клеток женского гаметофита в Arabidopsis.
Ученые использовали описанную ими же систему для культивации семязачатка in vitro – ранее ее использовали для наблюдения за ранним развитием растительного эмбриона. Сначала исследователи убедились, что в таких условиях динамика развития гаметофита (длительность клеточных делений) не отличается от нормы и показали, что таким образом можно наблюдать за гаметофитом до стадии оплодотворения.
Чтобы понаблюдать за каждым типом клеток гаметофита по отдельности, ученые заставили их вместе со специфическими для каждого типа клеток генами экспрессировать флуоресцентные белки разных цветов, а также пометили флуоресцентными белками плазматические мембраны и ядра клеток. Таким образом, при помощи флуоресцентной микроскопии исследователи видели в режиме реального времени, как и где происходит деление мегаспоры, и когда включается экспрессия тех или иных специфичных генов в клетках.
Ученые отметили, что судьба клеток определяется практически мгновенно после их формирования во время деления в зависимости от положения ядра в клетке. Например, маркеры яйцеклетки или клеток-антиподов экспрессировались уже через 1 час 40 минут после деления. А транскрипционным фактор, который считается специфичным для клеток-синергид, кроме самих синергид, сначала (на протяжении первого часа после формирования клеток) экспрессировался и в яйцеклетке и центральной клетке. Затем флуоресцентный сигнал, связанный с этим транскрипционным фактором, исчез в «лишних» клетках, и остался только в синергидах.
На видео – формирование клеток гаметофита и экспрессия специфичных для яйцеклетки и синергидных клеток маркеров.
Поскольку транскрипционный фактор MYB98, который должен был быть свойственным только для синергид, оказался активным и в других клетках, исследователи решили подробней изучить его функции. Ученые провели анализ экспрессии всех генов клеток гаметофитов растений дикого типа и с мутантным геном myb98 при помощи РНК-секвенирования. Выяснилось, что myb98 в целом влияет на экспрессию 392 генов в клетках гаметофита, и его отсутствие не только меняет строение синергидных клеток, но и направляет их развитие по типу яйцеклетки.
Кроме того, ученые заметили, что на схематичных изображениях предыдущих исследований, вакуоли в клетках гаметофитов изображены большими и по центру клеток. По наблюдениям авторов работы, вакуоли в женских гаметофитах динамично меняют свою форму, так же, как и в вегетативных клетках.
Флуоресцентная микроскопия позволяет ученым заглянуть не только в процессы развития клеток, но и проследить за динамикой отдельных молекул в клетках. Например, случайно изобретенная краска помогла исследователям проследить за клеточным транспортом.
Вера Сысоева
Но увеличиться в размерах им не удалось
Американские и бразильские исследователи представили результаты наблюдений за эволюцией клеток с синтезированным искусственно минимальным геномом. За две тысячи поколений они восстановили приспособляемость к внешним условиям, но не смогли увеличиться в размерах. Статья об этом опубликована в журнале Nature. В 2010 году сотрудники Института Дж. Крейга Вентера получили первую клетку с полностью искусственным геномом. Для этого они удалили собственную ДНК у бактерии Mycoplasma mycoides и заменили ее на несколько модифицированную, синтезированную в лаборатории. Она состояла примерно из миллиона пар азотистых оснований и содержала 901 ген. Клетка получила название JCVI-syn1.0. После этого исследовали задались целью выяснить, какой минимальный набор генов необходим клетке для самостоятельного выживания и размножения, и стали снабжать клетки все более урезанными геномами. О том, как это происходило, подробно рассказывает материал «Прожиточный минимум», вышедший в 2016 году, когда была создана версия JCVI-syn3.0 с минимальным геномом, который состоял всего из 473 генов. Этого оказалось недостаточно для устойчивого размножения и удобства экспериментов, и несколько генов пришлось добавить. Текущая версия JCVI-syn3B, о которой идет речь в новой работе, содержит 493 гена. На сегодняшний день это организм с наименьшим известным геномом, способный расти в чистой лабораторной культуре. Джей Ти Леннон (J. T. Lennon) из Университета Индианы с коллегами из Института Дж. Крейга Вентера и других научных центров Бразилии и США сравнили уровень накопления мутаций у организмов с минимальным и не минимальным геномами — JCVI-syn3B и JCVI-syn1.0. Чтобы минимизировать влияние естественного отбора, их предварительно акклиматизировали в стандартной жидкой питательной среде и последовательно выращивали несколько моноклональных популяций из одной забранной клетки. Оказалось, что среднее число мутаций на нуклеотид за поколение у них практически неразличимо: 3,25 × 10−8 против 3,13 × 10−8 (p = 0,667). Это наивысший уровень накопления мутаций, когда-либо зафиксированный у клеточных организмов, что соответствует имеющимся представлениям о том, что при меньшем геноме скорость мутаций выше (а у M. mycoides она высока изначально). Общее распределение мутаций по типам (инсерции, делеции, однонуклеотидные замены) также оказалось схожим (χ22 = 4,16; p = 0,125). Однако состав однонуклеотидных мутаций, которые составляли 88 процентов от общего количества, у JCVI-syn3B и JCVI-syn1.0 был разным. В обоих типах клеток замена гуанина или цитозина на аденин или тимин происходила значительно чаще, чем наоборот, однако степень этого неравновесия была разной: в 30 раз при не минимальном геноме и в 100 раз — при минимальном. Вероятно, это связано с отсутствием у последних гена ung, отвечающего за эксцизию неверно встроенного в ДНК урацила. Выяснив это, исследователи поставили эволюционный эксперимент, пронаблюдав за 2000 поколений в популяции из более чем 10 миллионов клеток. За такой период каждый нуклеотид их генома должен был мутировать более 250 раз, что создает неограниченное генетическое разнообразие для адаптации к среде. Таким образом, при прочих равных условиях потенциальная разница в путях естественном отборе между популяциями у JCVI-syn3B и JCVI-syn1.0 обусловлена только искусственным урезанием генома. Оказалось, что изначально она приводит к снижению максимальной скорости роста примерно наполовину. Однако этот показатель растет линейно со временем, и концу эксперимента приспособляемость клеток в двух группах практически сравнялась, а если оценивать ее относительно, то клетки с минимальным геномом эволюционировали на 39 процентов быстрее, и генетические паттерны эволюционных путей у них отличались. Наиболее выраженной особенностью JCVI-syn3B стало то, что в процессе эволюции их клетки не увеличивались в размерах, что обычно происходит при достатке питательных веществ (клетки JCVI-syn1.0 за это время увеличились в среднем на 85 процентов в диаметре и десятикратно в объеме). За это отвечали эпистатические эффекты мутаций в гене ftsZ прокариотического гомолога тубулина, который регулирует деление и морфологию клетки. Полученные результаты демонстрируют, что естественный отбор способен быстро повысить приспособляемость наипростейших автономно растущих организмов, причем минимизация генома открывает возможности вовлечения в эволюционный процесс ключевых генов, которые обычно эволюционируют медленно, пишут авторы работы. В 2022 году исследовательский проект LTEE представил результаты эволюционного эксперимента с 2000 поколений кишечных палочек с различными наборами исходных признаков. Оказалось, что, хотя генетическое разнообразие имеет существенное значение на ранних стадиях приспособления, основную роль в эволюционном процессе при бесполом размножении играют случайные мутации.