CRISPR-редактирование превратило самцов в стерильных реципиентов чужой спермы

Американские генетики и ветеринары опробовали создание мутантных стерильных сельскохозяйственных животных для того, чтобы в дальнейшем пересаживать таким свиньям, козлам и быкам сперматогенные клетки от самцов с ценными качествами и делать из них «суррогатных отцов». Для этого ученым пришлось клонировать животных, а также редактировать эмбрионы при помощи CRISPR для выключения в них гена NANOS2. Результаты экспериментов описаны в статье в Proceedings of the National Academy of Sciences.

Трансплантация сперматогенных стволовых клеток в семенники может быть востребована в медицине, например, таким способом теоретически можно вернуть фертильность мужчине после лучевой терапии рака (такая возможность уже была показана на обезьянах). Еще больше в этой технологии заинтересовано животноводство — при помощи пересадки материала от ценного самца-производителя в здоровые семенники стерильных самцов можно значительно увеличить количество потомства, обладающего заданными качествами.

Выведение «суррогатных отцов» сталкивается с двумя основными проблемами. Первая — собственно, пересадка клеток. Исследования на мышах показали, что в семенниках существует небольшая популяция предшественников сперматозоидов (сперматогониев), которые после выделения можно превратить в зрелые функциональные сперматозоиды. В экспериментах на мышиных моделях было подтверждено, что такие клетки действительно можно пересаживать, однако работает ли это на крупных сельскохозяйственных животных, было непонятно.

Вторая проблема касается стерилизации потенциальных реципиентов стволовых клеток. Их собственное семя должно быть полностью уничтожено, чтобы избежать конкуренции с материалом донора, при этом репродуктивная система должна нормально функционировать. В экспериментальных моделях это решалось локальным облучением семенников или химической стерилизацией препаратом бусульфаном. Однако эти методы приводят к накоплению мутаций в клетках репродуктивной системы, к тому же не гарантируют стопроцентной стерильности.

Исследователи из Центра репродуктивной биологии университета Вашингтона под руководством Йона Отли (Jon Oatley) попробовали решить проблему стерильности реципиентов путем создания трансгенных животных с мутацией в гене NANOS2. Этот ген играет ключевую роль в дифференциации половых клеток по мужскому типу, и при его выключении сперматозоиды не формируются.

Первый раунд экспериментов ученые провели на мышах, с уже готовой линией животных с выключенным NANOS2. Поддерживать такую линию в лаборатории можно благодаря тому, что стерильны только самцы с выключенными обеими копиями гена, а гетерозиготные самцы и самки сохраняют фертильность. Белым стерильным мышам месячного возраста успешно пересадили стволовые сперматогонии от доноров с черной шерстью, и подтвердили, что эта операция приводит к восстановлению фертильности, и что потомство на сто процентов несет генетический материал доноров. При этом у реципиентов не возникло иммунного отторжения донорского материала, о котором ранее беспокоились ученые.

После этого исследователи перешли к экспериментам на крупных животных — свиньях и козах, генетические операции с которыми уже довольно хорошо отработаны (например, здесь мы рассказывали, как китайцы вернули свиньям морозоустойчивость). Для получения мутантных свиней с мутацией в NANOS2 генетики сначала при помощи CRISPR-Cas9 получили свиные клетки соединительной ткани с двумя сломанными копиями гена. Затем при помощи переноса соматических ядер в яйцеклетку (таким способом клонировали овечку Долли) они клонировали эмбрионы, из которых, после подсадки суррогатным матерям, родилось несколько стерильных поросят.

К сожалению, у некоторых клонированных свиней возникли проблемы с костями, поэтому пересадить стволовые клетки в семенники удалось только двум боровам. По мере роста у них регулярно исследовали эякулят и проверяли наличие в нем сперматозоидов. У одного животного стволовые клетки действительно развились в сперматозоиды, однако их оказалось слишком мало для нормального оплодотворения. Тем не менее, ученые посчитали эксперимент успешным и повторили его на козах. Мутантные козы оказались здоровы, поэтому генетики заключили, что проблемы с костями у свиней были не связаны с выключением гена NANOS2. Сперматогенные стволовые клетки ввели трем козлятам, и через 136 дней после трансплантации у одного из них развились нормальные подвижные сперматозоиды.

В третьей серии экспериментов генетики попытались вывести стерильных мутантных быков. Для этого ученым пришлось провести CRISPR-редактирование эмбрионов, чтобы инактивировать в них ген NANOS2 (по-видимому, клонировать коров из фибробластов сложнее, чем свиней). Из 32 подсаженных эмбрионов родилось только два теленка, которые оказались мозаиками по гену Nanos2, то есть в некоторых тканях ген был сломан, а в некоторых оказался нетронутым (мозаичность — основная проблема CRISPR-редактирования эмбрионов, наряду с нецелевым редактированием). Тем не менее, биопсия тканей семенников показала, что бычки должны быть стерильными. Таким образом, авторы работы заключили, что выключение гена NANOS2 эффективно работает на разных видах сельскохозяйственных животных для получения стерильных реципиентов и будущего выращивания «суррогатных отцов».

Еще одно потенциальное применение этой технологии — сохранение вымирающих видов. К примеру, в настоящее время ученые пытаются спасти от окончательного вымирания северных белых носорогов. Все самцы этого подвида уже умерли, однако их замороженную сперму использовали для получения жизнеспособных эмбрионов путем оплодотворения в пробирке яйцеклеток оставшихся самок.

Дарья Спасская