Пересадка стволовых клеток от одного стерильного самца другому восстановила фертильность мышей

Ученые пересадили клетки яичек от одних мышей, которые были стерильны из-за отсутствия гена Cldn11 (кодирует белок плотных контактов гемато-тестикулярного барьера), другим, и в семенных канальцах стали развиваться функциональные гаметы. В результате оплодотворения яйцеклеток сперматозоидами этих мышей развились 11 мышат. Возможно, причиной восстановления фертильности стало изменение баланса между различными белками плотных контактов гемато-тестикулярного барьера, однако точный механизм пока неясен. Статья опубликована в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences.

Гемато-тестикулярный барьер формируется между кровеносными сосудами и семенными канальцами и защищает формирующиеся сперматозоиды от иммунной системы. Основа барьера — клетки Сертоли, отростки которых формируют между собой плотные контакты и разделяют пространство семенного канальца на базальную часть, где находятся стволовые клетки, и околополостную, где развиваются сперматозоиды. После того, как стволовая клетка (сперматогоний) делится митозом несколько раз, получается клон из нескольких связанных мостиками сперматоцитов. Сперматоциты мигрируют через гемато-тестикулярный барьер в околополостную часть и вступают в мейоз.

Если гемато-тестикулярный барьер становится проницаемым, мейоз сперматоцитов нарушается, что приводит к стерильности. Это может происходить, если не хватает белков, которые формируют плотные контакты между клетками Сертоли. Такие белки есть и на сперматогониях, и на сперматоцитах, хотя между этими клетками нет плотных контактов. Роль белков плотных контактов в стволовых клетках еще предстоит выяснить.

Ученые из Японии под руководством Мито Канацу-Синохара (Mito Kanatsu-Shinohara) из Киотского университета исследовали яички стерильных мышей, нокаутных по гену клаудина CLDN11, белка плотных контактов. Срезы яичек 11-месячных мышей иммуногистохимически окрашивали на различные маркеры. В том числе исследовали экспрессию маркеров апоптоза, чтобы узнать, какие клетки гибнут при выключении Cldn11.

Затем сперматогонии разрушали бусульфаном, который угнетает работу половых клеток, но не проходит через гемато-тестикулярный барьер. Ученые смотрели, как отсутствие белков плотных контактов на других клетках повлияет на клетки Сертоли.

Чтобы проверить, могут ли стволовые клетки семенников без CLDN11 дифференцироваться в нормальном микроокружении, сперматогонии нокаутных по Cldn11 и контрольных мышей (донорные клетки производили зеленый флуоресцентный белок) пересадили животным, сперматогонии которых были разрушены бусульфаном. После этого от тех же животных пересадили первичные стволовые клетки.

Наконец, сперматогонии пересадили от здоровых зеленых мышей (трансгенных животных, клетки которых выделяли зеленый флуоресцентный белок) нокаутным по Cldn11 особям. Чтобы выяснить, помогает ли отсутствие Cldn11 колонизации сперматогоний в яичках, гемато-тестикулярный барьер которых уже сформирован, ученые с помощью РНК-интерференции выключили этот ген у зрелых мышей дикого типа (эта процедура называется нокдаун).

У нокаутных по Cldn11 мышей размер яичек был меньше, чем у животных дикого типа; в придатках яичек и в семенниках не было зрелых сперматозоидов, хотя в семенных канальцах нашли половые клетки. Количество премейотических половых клеток вне гемато-тестикулярного барьера было снижено (p < 0,05). Экспрессия маркеров апоптоза была повышена в сперматоцитах, но не в сперматогониях.

При нарушении сперматогоний бусульфаном на клетках Сертоли было меньше не только CLDN11, но и клаудина CLDN3 и окклюдина, а экспрессия CLDN5 на базальной мембране была выше. Значит, и сперматогонии, и CLDN11 влияют на экспрессию белков гемато-тестикулярного барьера.

Сперматогонии, которые пересадили из нокаутных по Cldn11 мышей, дали значительно больше колоний, чем клетки из мышей дикого типа. После пересадки сперматогонии успешно дифференцировались. Однако пересадка первичных стволовых клеток не дала таких успешных результатов — их колонизация была ниже по сравнению с контролем, а после истощения CLDN3 и CLDN5 развитие половых клеток стало еще более слабым (p < 0,05). Вероятно, успешная колонизация сперматогоний в первом случае была вызвана недостатком дифференцирующихся половых клеток, а клаудины необходимы половым клеткам .чтобы проходить через гемато-тестикулярный барьер.

Сперматогонии нормальных мышей значительно лучше прижились в яичках нокаутных животных, чем контрольных (p < 0,05) и успешно дифференцировались в гаплоидные половые клетки. Авторы заключают, что CLDN11 в клетках Сертоли мешает колонизации сперматогоний. Результаты операции были еще лучше, если перед пересадкой мышам вводили лейпрорелином (p < 0,05). Это вещество подавляет работу гипоталамо-гипофизарной оси и увеличивает число колоний клеток донора.

Пересадка первичных половых клеток мышам, у которых Cldn11 был выключен, была более успешной, чем в контрольном эксперименте (p < 0,05), — снижение количества CLDN11 в клетках Сертоли улучшает колонизацию стволовых клеток и после того, как гемато-тестикулярный барьер сформирован.

Поскольку пересадка была успешной и если донором были Cldn11-нокаутные мыши, а рецепиентами — животные дикого типа, и наоборот, ученые предположили, что дифференциацию сперматогоний можно запустить, если эти клетки пересадить от одной нокаутной мыши другой после того, как ее яички обрабатывали бусульфаном. Действительно, после такой операции стволовые клетки приживались и превращались в сперматозоиды. Это происходило, даже если сперматогонии пересаживали из правого яичка нокаутных по Cldn11 мышей в левое.

Сперматозоиды, которые развились из трансплантированных клеток, использовали для искусственного оплодотворения яйцеклеток мышей дикого типа. В результате родились 11 мышат (26, если донором сперматогоний были мыши дикого типа).

Авторы работы предполагают, что восстановление фертильности произошло в результате изменения баланса клаудинов. Необходимо более подробно изучать функции различных клаудинов, чтобы разобраться в механизме их влияния на сперматогенез.

Есть еще один способ восстановить фертильность при пересадке клеток яичек, когда донором и рецепиентом является одна и та же особь. Для этого можно выделить половые клетки еще в детстве, заморозить их и использовать для заполнения яичников, если донор утратит фертильность.

Алиса Бахарева