Без лишней скромности

История этой премии начинается с маловероятного героя научной сенсации — одноклеточной водоросли хламидомонады (Chlamydomonas). Крохотный организм с двумя жгутиками для передвижения и светочувствительным глазком к 1980-м был известен разве что тем, что неутомимо стремился к свету. В начале 2000-х два будущих лауреата, Петер Хегеман и Георг Нагель, открыли и описали ее каналродопсины (или канальные родопсины) — светочувствительные ионные каналы, благодаря которым хламидомонады способны к . В 2005 году третий Нобелевский лауреат, Карл Дейссерот, внедрил каналродопсин в нейроны — так ему сначала удалось с помощью света вызвать возбуждение нейронов в клеточной культуре, а всего через два года — уже в мозге живой мыши. Спустя 20 лет оптогенетика стала рутинной практикой фундаментальной нейробиологии. Впрочем, стремительное распространение удобного инструмента породило нескромные ожидания: что благодаря светочувствительным каналам вот-вот удастся понять, какие именно нейронные сети порождают эмоции, поведение и сознание. Почему Нобелевский комитет предостерегает от этих претенциозных заявлений, но тем не менее использует их в собственном пресс-релизе?

Премия, которую не дали

Мозг — орган с чрезвычайно запутанной клеточной организацией: его работа обеспечивается десятками миллиардов нейронов, каждый из которых переплетается с соседями аксонами и дендритами в возбуждающих, тормозных и модулирующих синапсах. Соседние клетки зачастую выполняют совершенно разные, а иногда и противоположные функции. Проекции от одной нервной клетки могут вести в совершенно другую область мозга. А активность нейронных сетей развивается и угасает порой молниносно, на грани с эфемерностью — за тысячные доли секунды.

Британский молекулярный биолог и Нобелевский лауреат Франсис Крик писал, что изучение мозга — одна из главных проблем биологии, и для ее решения потребуется некий инструмент, который позволил бы точечно (в пределах популяции нейронов) и краткосрочно (в пределах миллисекунд) активировать или тормозить те или иные структуры. В качестве идеального стимула, который был бы способен «быстро включать и выключать активность одного или нескольких типов нейронов у бодрствующего животного», Крик предложил свет. Впрочем, к собственному провидческому предложению автор относился с должным скепсисом — и считал его маловероятным, если не притянутым за уши. 

Тем не менее уже в 2002 году появилось первое воплощение идеи Крика и предвестник современной оптогенетики — система ChARGe, которую создала группа Геро Мизенбека. Для ее работы требовалось экспрессировать в нейронах массивную конструкцию из светочувствительного каскада из омматидиев (глазков) дрозофилы. Нейроны, в которых экспрессировалась система ChARGe, после воздействия светом и добавления ретиналя генерировали . Но из-за того, что каскад от дрозофилы — это многостадийный процесс из нескольких звеньев, его развитие требовало времени. А значит, реакция на световой стимул оказалось слишком медленной: она занимала секунды, а не желанные миллисекунды.

Несмотря на довольно прозрачную связь ChARGe-исследований с последующим развитием оптогенетики, Геро Мизенбек в число лауреатов не вошел. На резонный вопрос «почему?» комитет уклончиво ответил, что обосновывает вручение премии, а не то, почему кому-то премии не досталось. Можно лишь предположить, что ChARGe оказалась слишком медлительной, многокомпонентной и непопулярной. Нужно было что-то другое — простое решение от простого организма. 

Изящное решение

Многоклеточные организмы применяют довольно тяжеловесные конструкции для решения тех или иных задач. Например, чтобы создавать энергетические молекулы, они используют отдельные органеллы — митохондрии и пластиды. Внутри митохондрий и пластид спрятана цепочка взаимодействующих белков и переносчиков — электрон-транспортная цепь. Она создает градиент ионов, который затем участвует в выработке энергетически емких молекул АТФ. 

Для чувствительности к свету тоже используется многокомпонентная система. В сетчатке млекопитающих это устроено так: 

• Пигмент (родопсин) поглощает квант света и переходит в активное состояние (метародопсин-II); 
• Метародопсин воздействует на G-белок (трансдуцин); 
• Трансдуцин запускает распад сигнальной молекулы (циклического гуанозинмонофосфата, цГМФ);
• Падение концентрации цГМФ приводит к закрытию ионных каналов; 
• Мембрана меняет заряд на более отрицательный (гиперполяризация мембраны); 
• Из-за гиперполяризации возникает нервный импульс, который передается в мозг. 

Одноклеточный организм таких широких жестов позволить себе попросту не может. Поэтому, например, бактерии для биоэнергетики и чувствительности к свету используют бактериальные родопсины — молекулы, которые без посредников и замороченных цепочек напрямую преобразуют энергию фотонов в перемещение ионов через мембрану. Так, к 1990-м у архей был описано несколько типов родопсинов, которые при воздействии светом начинали перекачивать протоны или ионы хлора с помощью одного-единственного белка, а не целого арсенала. Как оказалось, одноклеточные водоросли тоже предпочитают простые решения. 

На рубеже миллениума один из Нобелевских лауреатов этого года Петер Хегеман исследовал светочувствительные глазки хламидомонад. С помощью миниатюрных электродов он измерял электрические сигналы, которые возникали при попадании света. По сравнению с другими биологическими системами, известными исследователям того времени, эта реакция развивалась поразительно быстро: ток возникал за микросекунды. Единственное логичное объяснение такой скорости — фоторецептор и ионный канал водорослей должны или быть крайне тесно связаны, или вовсе представлять собой один трансмембранный белок, как у архей. 

Чтобы подтвердить эту гипотезу, требовалось, во-первых, найти гены, кодирующие этот белок, а во-вторых, выделить светочувствительный белок хламидомонады и определить его структуру.

Светочувствительное все

Первая задача была решена в 2000 году, когда японские исследователи составили карту ДНК хламидомонады и выложили базу данных в открытый доступ. Группа Хегеманна тогда обнаружила два гена, которые были схожи с бактериальными родопсинами — Chop1 и Chop2. Подтвердить, что гены действительно кодируют светочувствительный ионный канал, помог второй Нобелевский лауреат — Георг Нагель. Когда он экспрессировал обнаруженные Хегеманном гены в , они стали реагировать на свет слабыми электрическими импульсами. Белки назвали каналородопсинами первого и второго типа.

Каналродопсин-2 оказался чрезвычайно быстрым: всего через 0,2 миллисекунды после воздействия света он открывал ионную пору, что вызывало электрический импульс. Когда после ооцита лягушки его удалось экспрессировать в других типах клеток — Хегеманн и Нагель предположили, что каналродопсин-2 можно использовать как инструмент, позволяющий превратить любую клетку в светочувствительную.

Этим инструментом незамедлительно воспользовался третий Нобелевский лауреат — Карл Дейссерот. Запросив последовательность ДНК каналродопсина у Нагеля, Дейссерот с помощью лентивирусной конструкции экспрессировал ген в клеточной культуре нейронов. Когда ученые посветили на нервные клетки синим светом — они мгновенно отреагировали импульсом. В течение года каналродопсин-2 подтвердил свою эффективность в самых разных модельных объектах: культуре нейронов гиппокампа, двигательных нейронах спинного мозга, сетчатке, у живых нематод Caenorhabditis elegans и у личинок дрозофил Drosophilidae.

А 2007 год и вовсе выдался насыщенным. Во-первых, Дейссерот с коллегами разработали световой нейроинтерфейс. Он выглядит так: в нужную область мозга делают точечную инъекцию вируса с генетической конструкцией светочувствительного канала и затем подводят к ней тонкое оптоволокно, по которому подают световой сигнал, чтобы активировать эту область мозга живой мыши. В первом исследовании in vivo каналродопсин-2 экспрессировали в моторной коре, а затем с помощью оптоволокна, вживленного в двигательную кору, посветили на нее лазером. В ответ на световую стимуляцию нейроны активировались, а усики мыши задергались. 

Во-вторых, группа открыла бактериородопсин археи Natronomonas pharaonis (NpHR), который при воздействии светом открывал пору для отрицательно заряженных ионов. То есть, в отличие от каналродопсина-2, подавлял активность нейронов при воздействии светом. Теперь у ученых был не только включатель нейронов, но и выключатель.

Наконец, с помощью генетического таргетирования удалось создать генетически модифицированных мышей, у которых светочувствительные ионные каналы экспрессировались в одном специфическом . То есть воздействовать светом можно было не только сверхбыстро, но и сверхточно.

Так белок из ничем не примечательной водоросли всего за пять лет полноценно исполнил пророчество Крика. Желание «быстро включать и выключать активность одного или нескольких типов нейронов у бодрствующего животного» стало реальностью, а оптогенетика превратилась в бурно развивающуюся сферу науки.

Вы пробовали выключить и включить?

Появление оптогенетики сняло с нейробиологии множество методологических ограничений. До появления светочувствительных ионных каналов установить связь между активностью нейронов и функцией — от специфического типа поведения до памяти — можно было лишь с помощью электрофизиологии, фармакологического подавления или разрушения структур, а также методов нейровизуализации. Но все эти манипуляции были или недостаточно точными, или недостаточно быстрыми, или сразу и то, и другое. Как правило, по результатам таких экспериментов исследователи могли говорить о корреляции, но не о жестко очерченной каузальности. 

Светочувствительные ионные каналы сразу продемонстрировали, что способны поменять правила игры в фундаментальной нейробиологии. Характерным примером стала работа по изучению функции орексигенных нейронов гипоталамуса, опубликованная в 2007 году. До появления оптогенетики было известно, что они вовлечены в поддержание бодрствования, но оставалось непонятно: их электрическая активность — необходимое и достаточное условие для пробуждения; или их активность — просто сопутствующее бодрости явление? С помощью оптогенетики удалось показать, что активация орексигенных нейронов гипоталамуса приводит к . Не коррелирует, а приводит. 

Оптогенетика не только подсветила некоторые причинно-следственные закономерности в работе мозга, но и уточнила существующие знания о его структурном устройстве. Те центры и агломерации нейронов, которые раньше считались относительно однородными, сейчас дробятся на более мелкие функциональные единицы. Например, ранее дофаминергические нейроны среднего мозга всем скопом назначали ответственным за систему вознаграждения, неприятия и оценки значимости новых стимулов — сейчас с помощью точечного включения и выключения нейроны удалось разделить на подпопуляции: те, которые отвечают за стремление к вознаграждению, и те, которые отвечают за неприязнь. Тот же подход в префронтальной коре и миндалине позволил уточнить строение нейронных сетей, вовлеченные в контроль страха и тревоги. При активации базомедиальной амигдалы тревога снижается. В то же время вентромедиальная префронтальная кора вовлечена в отражение чужого страха — если подавить эту область, то мышь, наблюдающая за чужими страданиями, .

Наряду с поиском эмоций красочным примером применений оптогенетики стали исследования другого некогда эфемерного функционального модуля — энграммы памяти. До появления светочувствительных ионных каналов как части рутинной исследовательской практики они были гипотетическим объектом — неким ансамблем взаимосвязанных нервных клеток, который активируется при воспроизведении воспоминания. Отыскать физический субстрат памяти не удавалось, потому что у ученых не было точечного доступа к конкретным клеткам, вовлеченным в энграмму. В 2012 году в лаборатории с помощью генетических меток (activity-dependent genetic labeling) ученые экспрессировали каналродопсин-2 исключительно в нейронах гиппокампа, которые были активны во время выработки рефлекса страха. Затем с помощью света они стимулировали эти нейроны у животного — и даже когда мышь была в безопасности, оптогенетическая стимуляция ансамбля нейронов вызвала неприятное воспоминание (или просто страх?).

Это лишь некоторые примеры функциональных модулей, которые удалось обнаружить с помощью оптогенетики. Каналродопсины позволили довольно точно определить локальные сети нейронов, вовлеченные в различные типы поведения: материнского поведения и эмпатии, аппетита и жажды, боли и удовольствия. 

Но хотя оптогенетика действительно встряхнула фундаментальную нейробиологию — как это сделали ранее окрашивание по Гольджи, метод локальной фиксации потенциала (Нобелевская премия 1991 года) или функциональная МРТ — следует придерживаться стратегии осторожного воодушевления. Выделение нейронных сетей страха и тревоги у крыс пока что никак не поможет нам познать радость. Эмпатия, обнаруженная в оптогенетических исследованиях, — это отражение лишь чужого страха, а не ее полноценная форма. К тому же эксперименты на животных не всегда удается успешно транслировать на человека, особенно когда дело касается таких вопросов, как эмоции, память, поведение и уж тем более — сознание. Разобрать мозг на мелкие функциональные модули еще не означает понять его в целостности: эта система может оказаться больше, чем просто суммой ее частей. 

Впрочем, когда Дейссерот вживлял каналродопсин в нейроны, он держал в голове вовсе не вопросы об эмоциях или природе сознания, а куда более утилитарную цель — помочь своим пациентам.

Лечение светом

В начале карьеры Карл Дайссерот планировал стать нейрохирургом, но после  практики в психиатрической клинике, которую он прошел в рамках обучения  в университете, — остался в психиатрии, и наряду с исследованиями в нейробиологии до сих пор ведет прием пациентов. По словам самого Дайссерота, с 1990-х его занимает вопрос — почему у пациентов с психиатрическими и нервологическими отклонениями мозг работает настолько иначе? Почему людям с депрессией так трудно испытывать радость? Что вызывает аутизм или шизофренический бред?

Все эти вопросы до сих пор остаются без ответа. Однако возможность точечного воздействия на нейронные сети сыграет важную роль в установлении причинно-следственных связей между нарушением нейронных цепей и симптоматикой различных заболеваний. Каналродопсины в генетических моделях расстройств аутистического спектра (РАС) на животных используют для выявления тех нейрональных сетей, которые сбоят при РАС и приводят к нарушению социальных функций. Схожим образом их используют для выявления механизмов развития нейродегенеративных заболеваний, шизофрении и депрессии. Оптогенетические исследования помогут лучше понять, что ломается в мозге и, следовательно, уточнить терапевтические цели. Кроме того, оптогенетика сама по себе может стать лечением. 

В теории инвазивные способы лечения — такие как глубокая стимуляция мозга при фармакорезистентной эпилепсии или болезни Паркинсона — можно модифицировать и улучшить с помощью оптогенетического подхода. Но в то же время ее широкое применение в клинической практике затруднено, потому что объединяет сразу две инвазивные и пока что этически неоднозначные методики — генетическое редактирование (введение вирусного вектора, несущего каналродопсин) и вживление световода в головной мозг.

Тем не менее первые шаги по внедрению оптогенетики в медицину уже сделаны. Сейчас с ее помощью исследователи пытаются восстановить зрение у пациентов с пигментным ретинитом — наследственной формой слепоты, при которой в сетчатке разрушаются рецепторы: палочки и колбочки. Экспериментальное лечение проходило так: в сетчатку глаза слепого человека ввели канальный родопсин ChrimsonR, а затем с помощью очков на сетчатку подали сигнал — трансформированный в световые импульсы образ окружающей действительности. Благодаря этому подходу к пациенту частично вернулось зрение — он смог различать высококонтрастные объекты на столе и брать их в руки. 

С некоторой вероятностью каналродопсины могут применяться и для восстановления слуха: если заменить конвенциональные электродные решетки в кохлеарном импланте на оптогенетическую стимуляцию, он будет активировать слуховой нерв с большей точностью, чем существующие системы. (Впрочем, кохлеарные импланты — уже крайне успешный искусственный орган чувств. Подробнее про кохлеарные импланты мы писали в тексте «Я вас услышала»).

***

В пресс-релизе и научно-популярном обосновании премии по физиологии или медицине Нобелевский комитет позволил себе несколько довольно филлерных и огульных формулировок, что с помощью оптогенетики исследователи «могут оживлять воспоминания, вызывать эмоции, управлять поведением». Даже в научном обосновании проскользнула фраза, что «мы теперь можем установить точные причинно-следственные связи, определяющие то, как мозг кодирует мышление, эмоциональные и поведенческие процессы». Эмоции, воспоминания и мышление — это вроде бы понятные слова, которые, тем не менее, допускают слишком широкие трактовки и оттого звучат нескромно.

Тем не менее, во время очной пресс-конференции члены комитета призывали к сдержанности. Так, на вопрос о том, откроет ли оптогенетика природу сознания спикер осторожно ответил: «Нам следует быть скромнее с грандиозными вопросами. Я уверен, за исследования сознания присудят Нобелевскую премию в ближайшие годы». «Может, через сотню лет», — тут же шепотом добавил он. 

История этой премии довольно поучительна. Фрэнсис Крик мечтал об активации мозга светом. Сам же в соседнем предложении осекался, называл озвученную идею «притянутой за уши». Но вот мы тут — и скромность Крика кажется лишней. Но это и не повод давать волю всем неосторожным фантазиям.