Это на вырост

За несколько дней до объявления первых Нобелевских лауреатов 2024 года журнал Nature составил портрет среднестатистического нобелиата, собрав данные за 123 года существования премии и обобщив биографии 646 ее получателей. Виктор Эмброс и Гэри Равкан вписываются в этот образ идеально: они оба немолоды и выросли в США, начали свою карьеру под руководством других нобелиатов и прождали своей премии почти 30 лет. Но есть одно обстоятельство, которое выделяет их судьбу из общего ряда: про их открытие однажды уже писали в Нобелевском пресс-релизе. Это было 18 лет назад, когда премию присудили другим людям. Рассказываем, как так получилось и почему Эмбросу и Равкану пришлось так долго ждать своей награды.

1980-е. Что не так с этими червями?

Когда Виктор Эмброс и Гэри Равкан пришли в лабораторию Роберта Хорвица — будущего нобелевского лауреата, — они не собирались заниматься взаимодействием генов. Их интересовали странные нематоды-мутанты, которых вывели в группе Хорвица. Эти черви не просто выглядели нездоровыми и жили недолго, как это часто бывает с животными, у которых выключен какой-нибудь жизненно важный ген. Они очень необычно росли — как будто запутались в своей программе развития.

Caenorhabditis elegans, у которых был сломан lin-4, развивались на несколько часов медленнее обычных червей, а потом останавливались на пятой из семи личиночных стадий и дальше уже не росли. У них не появлялось ни взрослых покровов, ни половых органов — так что откладывать яйца они не могли. Зато работали половые железы, поэтому новое поколение нематод начинало выводиться из яиц прямо внутри тела — и родители закономерно погибали вместе с потомством.

Мутанты по lin-14 вели себя строго наоборот: они стремились перевыполнить план развития. То, что их клеткам было положено делать на второй личиночной стадии, они начинали уже на первой, а программу третьей стадии запускали на второй. Ничего хорошего из этого опять не выходило — потомства эти нематоды тоже не оставляли.

Взявшись выяснять, что с этими нематодами не так, Эмброс и Равкан первым делом подтвердили, что черви из обеих групп были гетерохроническими мутантами: в их организме программа развития включалась в нужных клетках, но в ненужное время. А потом заметили, что эффекты разнонаправленные. Как будто гены lin-4 и lin-14 оба отвечают за сроки развития, но двигают их в разные стороны. Причем экспрессия lin-14 меняется и у тех, и у других мутантов.

К концу 1980-х Эмброс и Равкан получили новые постоянные позиции и разошлись по разным исследовательским группам. Но совместную работу не бросили. Они продолжили выяснять, как связаны между собой lin-4 и lin-14. Можно было бы просто предположить, что один из них кодирует белок, который регулирует работу другого. К тому времени уже было давно известно, что на экспрессию генов влияют не только внешние факторы, но и другие гены, образуя сложные регуляторные сети. Но эта конкретная пара генов вызывала подозрения.

1993. Что не так с этими генами?

Равкан сконцентрировался на lin-14. Особенность этого гена была вот в чем: у некоторых червей мутации в нем пришлись на области 3′-UTR, которая не кодирует белок. У животных с такими мутациями белок lin-14 получался обычного размера и с тем же аминокислотным составом (что логично, раз изменения гена затрагивают только «бессмысленную» область), но почему-то задерживался в клетках дольше положенного. То есть некодирующая часть гена все-таки как-то влияла на судьбу белка — но было непонятно, как именно.

С lin-4, который изучал Эмброс, все тоже было сложно: по нему почему-то был известен только один мутант. Иными словами, этот ген получалось сломать только в одном месте, и это было странно — как будто нуклеотиды в любых других его местах совсем не были важны. Даже никак не влиял на его функцию. Получалось, что информация, записанная в lin-4, вообще не имела никакого смысла.

К 1993 году группы Равкана и Эмброса секвенировали каждая свой ген и смогли сравнить их последовательности. Оказалось, что lin-14 намного длиннее, чем lin-4, и содержит участок, частично ему комплементарный — ровно тот, где находится нетранслируемая область. То есть, встречаясь в клетке, две РНК этих генов могут склеиться — как длинная застежка (РНК lin-14) в сандалиях сцепляется с короткой липучкой (РНК lin-4). Короткая некодирующая РНК (которую позже назовут микроРНК) в этом случае мешает длинной информационной РНК работать, и процесс передачи информации останавливается.

Такого взаимодействия между генами у эукариот никто еще не видел. Но поскольку других примеров работы этого механизма не было, биологи не придали открытию большого значения. Мало ли какие молекулярные процессы встречаются в клетках у нематод.

1998. Могущественная РНК (но не та)

Не все, впрочем, так легкомысленно отнеслись к этой работе. Эндрю Файр и Крейг Мэлло, которые тогда вместе работали в Институте Карнеги в Вашингтоне, тоже изучали взаимодействующие РНК у нематод. Они знали, что у бактерий встречается простое слипание РНК: если к кодирующей (смысловой) РНК прилипает некодирующая (антисмысловая), то это мешает рибосоме считывать белок. И видели статьи Эмброса и Равкана, в которых те описывали похожий процесс (некодирующий продукт одного гена слипался с кодирующим продуктом другого и таким образом регулировал его экспрессию) уже у эукариот. И читали про исследования на растениях: там получалось, что, если ввести в клетку копию гена, то иногда он начинает работать не лучше, а хуже.

Попытавшись воспроизвести аналогичные процесс на нематодах, они тоже получили противоречивые результаты. Файр и Мэлло пробовали вводить в клетку и антисмысловую РНК (комплементарную к продукту нужного гена), и смысловую (повторяющую продукт) — но в обоих случаях эффект был слабый и воспроизводился плохо.

Зато все получилось, когда они ввели в клетки нематод двуцепочечную РНК — комплекс смысловой и антисмысловой. Мишенью выбранной РНК стал ген unc-22, отвечающий за мышечный белок. Под действием двуцепочечной РНК черви начали характерным образом дергаться — так обычно ведут себя мутанты по unc-22, у которых ген не работает. Этот процесс — в ходе которого двуцепочечная РНК подавляет экспрессию гена — назвали РНК-интерференцией.

Файр и Мэлло заключили, что, раз для интерференции им понадобилась двуцепочечная РНК, то механизм у эукариот устроен сложнее, чем у бактерий, и не сводится к простому слипанию. Постепенно разобравшись, как это работает, они получили примерно такую схему:

1. в клетку попадает двуцепочечная РНК;
2. ее распознает белок Dicer и режет на небольшие фрагменты — двуцепочечные малые интерферирующие РНК (миРНК);
3. из этих двух цепей смысловую выбрасывают, а антисмысловую («гидовую») оставляют и загружают в белковый комплекс RISC;
4. RISC подплывает к своей мРНК-мишени, «ловит» ее на гидовую цепь и расщепляет на кусочки;
5. цель достигнута, мРНК больше не существует.

Файр предположил, что этот не самый очевидный механизм, в котором антисмысловая РНК не работает в одиночку, — система внутриклеточной . Распознать вирусную РНК можно как раз потому, что она часто бывает двуцепочечной. Поэтому чтобы воссоздать эту ситуацию в клетке, нужно имитировать вирус — и использовать именно двуцепочечную РНК.

Принцип РНК-интерференции выглядел понятным и легко воспроизводимым. Поэтому статью Файра и Мэлло заметили сразу, и уже в следующем году появились исследования, использующие принцип РНК-интерференции. И это фактически был готовый исследовательский инструмент: достаточно синтезировать двуцепочечную РНК, комплементарную нужному гену, и ввести ее в клетку, чтобы этот ген перестал работать.

2000. Каждый по-своему нематода

А вот открытия Эмброса и Равкана несколько лет пролежали без внимания. Возможно, потому что они описали принцип взаимодействия генов, но не предложили готового понятного инструмента. А может быть, потому что этот принцип не выглядел универсальным.

Известность он получил только через семь лет, когда группа Равкана нашла вторую микроРНК. Эта микроРНК, let-7, как и lin 4 и lin-14, регулировала процессы перехода между личиночными стадиями. Нематоды с дефектами в этой микроРНК тоже были гетерохроническими мутантами: первые несколько линек у них проходили по графику, а потом, вместо того, чтобы переходить на следующую стадию, клетки начинали воспроизводить предыдущую. Поэтому жили такие черви недолго. Но, в отличие от первой микроРНК, let-7 оказалась многофункциональной: она умела связываться с нетранслируемыми областями сразу в пяти разных генах (включая и lin-14). Механизм, который открыли Эмброс и Равкан, оказался не просто не уникален для пары lin-4/lin-14, — на нем держалась целая сеть взаимодействий между генами, координирующими развитие нематоды C. elegans.

И сразу же выяснилось, что так не только у нее. Равкан и коллеги нашли родственников let-7 в геномах множества животных: у других нематод, у кольчатых червей, моллюсков, мух, иглокожих, а также у всех хордовых и позвоночных, включая человека. Единственные животные, у которых не нашлось let-7, — те, кого относят к двухслойным: стрекающие, гребневики и губки. У растений, одноклеточных эукариот и бактерий ее тоже не оказалось. По всей видимости, эта микроРНК стала приобретением первых животных, которые стали трехслойными.

У всех беспозвоночных и у рыб let-7 занимается примерно тем же, чем у нематоды: регулирует программу развития и переход между личиночными стадиями. У позвоночных этих стадий нет, поэтому и функции этой микроРНК другие. Например, в человеческих клетках она регулирует деление и смерть клеток, а также работу некоторых генов иммунного ответа. Эта микроРНК оказалась настолько полезной, что, один раз возникнув, уже не терялась из животного генома.

После исследований let-7 работы Эмброса и Равкана игнорировать перестали. Стало ясно, что в 1993 году биологи обнаружили не уникальный случай взаимодействия РНК, а принципиально новый механизм, который регулирует экспрессию генов по всему животному царству. И что таких микроРНК должно быть не две, и даже не пара десятков, а тысячи. Оставалось их только найти.

2006–2018. От премии до таблетки

Но если с микроРНК предстояло только разобраться, то миРНК в начале 2000-х уже можно было использовать. С помощью нее, например, можно было изучать функции конкретных генов по отдельности — выключая в клетке то один, то другой. А можно было создать трансгенный организм, в котором по определенному сигналу будет производиться длинная РНК, сворачиваться в двуцепочечную шпильку и запускать РНК-интерференцию.

Все это молекулярные биологи освоили быстро. И через восемь лет после выхода ключевой статьи Файра и Мэлло, когда им присудили Нобелевскую премию, об РНК-интерференции уже говорили как о возможном варианте генной терапии. (Похожую историю мы видели совсем недавно: тогда биологи обнаружили еще одну древнюю систему защиты от вирусов — под названием CRISPR/Cas, — которая обещала стать удобным молекулярным инструментом. И всего через шесть лет после открытия за нее уже вручили Нобелевскую премию, хотя терапия на базе CRISPR/Cas тогда еще не появилась.)

А если получается на клетках и мышах, почему бы не использовать тот же прием и в живом человеке? Чтобы довести терапию до клиники, понадобилось еще двенадцать лет. Нужно было подобрать РНК такого размера, чтобы на нее не слишком активно реагировала иммунная система — потому что если она тоже примет молекулу за вирусную, то начнется воспаление и до клетки лекарство может и не добраться. А еще нужно было проследить, чтобы у РНК не было побочных эффектов — чтобы она не связывалась с другими мРНК-мишенями.

К 2018 году эти проблемы решили, и на рынок вышло первое лекарство на основе РНК-интерференции — для лечения наследственного амилоидоза. Через год появилось второе — от острой печеночной порфирии. Сейчас таких лекарств в мире одобрено пять, и пока все они направлены на болезни, связанные с печенью. Но нет причин думать, что со времен их не станет больше, а сфера применения расширится. Например, в России в разгар пандемии разрабатывали лекарство от ковида, тоже основанное на этом принципе.

2006–2024. От премии до премии

А вот лекарств на основе микроРНК до сих пор нет. Хотя теоретически это реализуемо: можно сделать анти-микроРНК, которая блокировала бы действие реальной микроРНК. Или наоборот: попробовать усилить работу уже существующих. Но даже в качестве молекулярных ножниц в эксперименте их используют не так часто. Отчасти дело в том, что механизм, по которому они работают, оказался гораздо хитрее, чем в случае с миРНК.

Во-первых, микроРНК не так специфична. За двадцать с лишним лет выяснилось, что let-7 — не исключение: многие микроРНК могут регулировать работу сразу нескольких генов. Это возможно благодаря тому, что они связываются с геном не по всей своей длине, а только коротким «затравочным» участком. Верно и обратное: многие гены могут регулироваться сразу несколькими микроРНК. Получается сложная сеть взаимодействий, в которой непросто разобраться. Еще сложнее подобрать молекулу, которая оказывала бы только один конкретный эффект.

Во-вторых, микроРНК, в отличие от миРНК, действует через множество молекулярных механизмов. Она может разрушать мРНК или тормозить продвижение по ней рибосомы, а может вообще связываться с ДНК и влиять на ее метилирование (расположение эпигенетических меток, которые регулируют активность гена).

Но все, что происходит с микроРНК вне ядра, очень похоже на РНК-интерференцию — там даже задействованы те же белки. И это неспроста. Судя по всему, РНК-интерференция — эволюционно более древний механизм. Она встречается не только у животных, но и у других многоклеточных, и даже у одноклеточных протистов. Очень вероятно, что процесс, в котором участвует микроРНК, — эволюционная дочка РНК-интерференции. Но по разнообразию функций и механизмов дочка сильно превзошла своего родителя.

В клетках млекопитающих РНК-интерференция уже не играет такой важной роли, как у одноклеточных или беспозвоночных, — мы умеем защищаться от вирусов и другими способами. А вот микроРНК работают вовсю. По разным оценкам, сейчас известно от 500 до 2500 микроРНК в одном только человеческом геноме. Причем, как правило, они включаются не на ранних стадиях развития, а на поздних — там, где нужно регулировать дифференцировку и деление клеток. Поэтому работу микроРНК часто связывают с образованием опухолей, когда деление или дифференцировка нарушены.

Это позволяет использовать микроРНК, например, в качестве маркеров — ученые отслеживают с их помощью не только опухолевый рост, но и развитие деменции или последствия травм головы у футболистов. И на этом функции микроРНК, скорее всего, не заканчиваются. Известно, что клетки обмениваются ими, как посылками, заключенными в мембранные пузырьки. С помощью таких посылок они, вероятно, передают сигналы о стрессе — как в пределах одного организма, так и клеткам потомства.

Механизм РНК-интерференции оказался проще и универсальнее (отчасти потому, что древнее), и поэтому он раньше дождался практического применения, а его первооткрыватели — премии и известности. Регуляция с помощью микроРНК устроена куда хитрее: она позволяет тоньше настраивать работу генов и координировать сложные процессы. Но что удобно для клетки, не обязательно удобно для исследователя. За открытие универсального и красивого, но запутанного механизма Виктору Эмбросу и Гэри Равкану пришлось заплатить по меньшей мере временем, которое потребовалось, чтобы найти, изучить, разобраться, оценить значимость и масштаб — а потом дождаться признания.