Это свои

мРНК-вакцины у всех на слуху, а у некоторых — даже в плече. Но так было не всегда. Задолго до пандемии Каталин Карико и Дрю Вайсман придумали, как убедить человеческие клетки, что РНК из вакцины — такая же, как их собственная. Гораздо сложнее оказалось убедить окружающих — инвесторов, коллег и пациентов, — что эта молекула может работать лекарством или прививкой. За тридцать лет Карико, Вайсман и мРНК-вакцины преодолели несколько карьерных кризисов — а потом общечеловеческий кризис привел их к Нобелевской премии.

Действуйте по инструкции

Переехав в конце 1980-х из Венгрии в Филадельфию, Каталин Карико хотела заниматься генной терапией — вводить в человеческий организм гены, чтобы помочь ему произвести нужные белки. Денег на эти исследования ей никто не давал.

К тому моменту ученые умели генетически модифицировать и клетки, и целые организмы: бактерии, растения и даже мышей. Для этого в клетку подселяли нужный участок ДНК и заставляли его встроиться в геном. Но с человеком так поступить было невозможно. Во-первых, нельзя было допустить, чтобы введенная извне ДНК закрепилась в его геноме. А во-вторых, даже у мыши эффективность такой процедуры была невелика: крупной молекуле нужно пересечь сначала внешнюю мембрану клетки, а затем еще две ядерных.

Карико предлагала использовать не ДНК, а матричную РНК — посредника между ДНК и белком. мРНК несет ту же информацию, что и ДНК, но синтез белка происходит уже в цитоплазме клетки, так что в ядро ей проникать не нужно. Интегрироваться в геном она поэтому тоже не может. Потенциальных грантодателей это не убеждало — потому что вместо двух старых проблем возникали две новые.

Во-первых, мРНК очень нестабильна — считалось, что она не способна попасть в клетки в нужной концентрации. Ученые опровергли это только в 1989-м году, когда оказалось, что клетки вполне охотно поглощают мРНК, если смешать ее с капельками жира.

Вторая проблема была серьезнее: мРНК вызывала в организме животных воспаление, иногда смертельное. Препарат с такими побочными эффектами не дошел бы до клинических испытаний. Никто не верил, что эту технологию можно перенести на людей, — и заявки у Карико не принимали.

К 1995 году это неверие обернулось для ученой карьерным кризисом. Университет Пенсильвании, где она рассчитывала стать профессором, предложил ей выбрать между понижением и увольнением. Она предпочла остаться — и отложить до лучших времен свои попытки сделать из мРНК лекарство.

Попробуйте мРНК

Ждать пришлось недолго: в 1997 году в университет из Бостона переехал Дрю Вайсман — и ему мРНК пришлась очень кстати. Вайсман искал вакцину от ВИЧ. Свою карьеру он начинал под руководством Энтони Фаучи — человека, который исследовал вирус еще на старте американской эпидемии, — поэтому знал из первых рук, как этот вирус ускользает от иммунитета (в материале «Без вакцины» мы рассказывали, почему ее до сих пор нет). Но у него была надежда.

В то время иммунологи активно изучали дендритные клетки (за них в 2011 году присудили половину Нобелевской премии). Эти иммунные клетки помогают работе Т-лимфоцитов, презентируя им антигены. Если какая-нибудь из Т-клеток узнает антиген, дендритные клетки активируют ее и заставляют делиться и искать этот антиген по всему организму. Поэтому организовав собственную лабораторию, Вайсман решил тоже поставить с дендритные клетки: вводить вирусный антиген не в кровь, а напрямую в эти клетки. А Карико предложила: попробуйте мРНК.

Это исследование не вызвало вопросов у грантодателей: по плану Вайсмана, вакцина должна была работать in vitro. В эксперименте сначала у мыши забирали дендритные клетки, потом эти клетки «прививали», то есть кормили мРНК с вирусным геном, потом к ним подсаживали Т-лимфоциты. После этого активированные лимфоциты можно было вводить мышам обратно. В этой схеме не было риска, что у животных разовьется воспаление.

Работа с этим экспериментом вышла в 2000 году. У будущих нобелиатов все получилось: дендритные клетки проглотили мРНК и активировали Т-лимфоциты.

Но произошло незапланированное: дендритные клетки стали сами активироваться выделять провоспалительные белки. С одной стороны, эти белки стимулировали T-клетки. С другой — были источником воспаления. Они же отделяли Карико и Вайсмана от создания мРНК-вакцины.

Примите человеческий вид

Соавторы взялись выяснять, как именно дендритные клетки реагируют на мРНК. И сразу подумали про . Это рецепторы врожденного иммунитета, которые есть на разных иммунных клетках, в том числе и на дендритных. TLR реагируют на  — молекулы, которых в норме не должно быть в крови и тканевой жидкости. Например углеводы из клеточной стенки бактерий или белок бактериального жгутика. Или вирусная РНК.

Бум исследований TLR пришелся как раз на 2000-е годы (в 2011 году за них присудили вторую часть Нобелевской премии, напополам с открытием дендритных клеток). Каждый год иммунологи выясняли, какой из рецепторов этой группы на что реагирует. Поэтому Карико и Вайсман уже знали, что TLR3 — ловит двухцепочечную РНК (такая бывает только у вирусов, в эукариотической клетке она почти всегда из одной цепи), а TLR7 и TLR8 — тоже вирусную, но одноцепочечную. Они проверили дендритные клетки — и обнаружили, что на мРНК реагируют все три типа рецепторов. Причем на вирусной РНК в клетках плохо шла транскрипция: по какой-то причине рибосомы сопротивлялись и производили меньше вирусного белка, чем должны бы. Эти результаты выглядели неожиданно.

Во-первых, мРНК в эксперименте была одноцепочечная, поэтому было непонятно, как на нее среагировал TLR3. С этим исследователи быстро разобрались: оказалось, что в процессе синтеза мРНК — а его проводили in vitro, используя ДНК и полимеразу, — получалась примесь двухцепочечной РНК. На нее и срабатывал TLR3.

Понять, почему среагировали TLR7 и TLR8, было сложнее. Допустим, вирусная РНК чем-то непохожа (хотя и непонятно чем) на эукариотическую. Но как рецепторы отличили человеческую мРНК, созданную в пробирке, от человеческой мРНК, созданной в клетке?

К этому времени аналогичную проблему с ДНК уже решили. Выяснилось, что рецептор TLR9, который реагирует на бактериальную ДНК, но не на человеческую, отличает их по метильным меткам. У эукариот эти метки часто висят на цитозине в участках генома, богатых ГЦ-парами, а прокариоты метилируют ДНК в других местах — поэтому последовательности с большим числом ГЦ-пар у них оказываются лысыми и служат образом патогенности. Карико и Вайсман заподозрили, что TLR-рецепторы и РНК различают по набору меток.

Уже несколько лет было известно, что отличия между разными РНК действительно есть. Эукариотические клетки навешивают на азотистые основания в своей РНК самые разные метки: добавляют метильную группу, убирают аминогруппу или меняют кислород на серу. Это помогает цепочке РНК сворачиваться и принимать нужную форму, а клеточным белкам — узнавать ее и прикрепляться к ней. В итоге набор меток оказывается разным в зависимости от типа РНК и ее функций внутри клетки.

Например в транспортной РНК, которая подносит аминокислоты в рибосому, изменен каждый четвертый нуклеотид. В мРНК, которая несет информацию о белках, модификаций меньше — но все равно на порядок больше, чем в клетках прокариот и в геноме большинства вирусов. Хотя некоторые вирусы, судя по всему, об этом догадываются — потому что у вирусов гриппа и герпеса, например, модификаций даже больше, чем в человеческой мРНК.

Поэтому Карико и Вайсман предположили, что TLR-рецепторы, как и в случае с ДНК, ориентируются на метки на азотистых основаниях. Стало понятно, почему они среагировали и на искусственную РНК. Чтобы размечать РНК и менять ее нуклеотиды, в клетках есть целый набор ферментов, а мРНК для вакцины синтезировали с помощью одной лишь полимеразы, никаких других ферментов в системе in vitro не было. Неудивительно, что для TLR-рецепторам она показалась вирусной. Оставалось выяснить, какой набор меток позволит мРНК выглядеть человеческой.

Простым перебором эта задача не решалась: уже тогда биологи знали около сотни разных модификаций РНК-нуклеотидов. Поэтому сначала будущие нобелиаты подействовали на дендритные клетки разными типами РНК: как человеческими, так и бактериальными, — чтобы определить, какие из них вызывают самый сильный отклик. А потом сравнили набор химических модификаций в них и вносили нужные — уже в искусственные мРНК.

Оказалось, что TLR-рецепторы реагируют не на одну метку, а на разные. Можно было внести в мРНК 5-метилцитозин, N6-метиладенозин, 5-метилуридин, 2-тиоуридин или N1-метил-псевдоуридин — и в любом случае дендритные клетки выделяли меньше провоспалительных белков. Причем чем больше меток, тем лучше. Эффект можно было заметить, даже когда измененных оснований было всего 3–6 на цепочку из полутора тысяч нуклеотидов. А когда ученые увеличили долю модифицированных нуклеотидов до 2,5 процента, дендритные клетки замолчали — и перестали подавать сигналы тревоги.

Оставайтесь на линии

Эти эксперименты заняли буквально несколько лет. Только в 2000 году Карико и Вайсман впервые накормили дендритные клетки мРНК, кодирующей белок ВИЧ, — а уже в 2005 выяснили, как сделать так, чтобы не возникало воспаления.

За следующие несколько лет они выяснили, какие сигнальные пути соединяют TLR-рецепторы с другими молекулами внутри дендритных клеток и какие ферменты не дают рибосомам строить белки с РНК, похожих на вирусные, научились очищать искусственно синтезированную РНК от двухцепочечных примесей и выяснили, что для того, чтобы мРНК не вызывала иммунного ответа, достаточно только одного типа метки — псевдоуридина. Проблема, казалось, была решена: такая вакцина стала безопасной для людей — осталось взять и сделать ее.

Делать взялись сразу несколько компаний. Первыми работать с мРНК-вакцинами начали в компании Curevac еще в 2000 году, так что воспользоваться открытиями Карико и Вайсмана не могли. Возможно поэтому спустя 20 лет их вакцина от ковида оказалась не такой эффективной, как у конкурентов.

В 2008 году появилась компания BioNTech. Она планировала делать персонализированные вакцины от рака — и сразу взяла на вооружение принцип модификации нуклеотидов. В 2010 году возникла Moderna — которая сначала вообще не собиралась заниматься вакцинами. В ее планах было разработать что-то вроде генной терапии: с помощью мРНК превращать взрослые клетки в эмбриональные и выращивать из них нужные пациенту ткани.

Но быстрой мРНК-вакцины не получилось: нужно было определиться с мишенью, выбрать подходящий ген, научиться прицельно доставлять его в клетки. И прежде чем переходить к людям, проверить на животных, что терапия или вакцинация не вызывает побочных эффектов — а они иногда все равно возникали.

К 2013-му энтузиазм по поводу мРНК-вакцин угас — причем настолько, что Карико опять осталась без финансирования. На этот раз она все-таки уволилась из Университета и перешла в BioNTech — которая к тому моменту еще не имела ни публикаций, ни разработок. За это время ее дочь успела дважды завоевать золотую медаль по гребле на Олимпийских играх, и Каталин — как она сама призналась в интервью пресс-службе Нобелевского комитета — привыкла быть просто «мамой Сьюзан» на церемониях. И только мама самой Каталин продолжала надеяться на свою дочь и каждый год в начале октября включала радио, чтобы услышать, что она стала Нобелевским лауреатом. А та смеялась: «Что ты, мама, мне даже гранты не дают».

***

Гранты, известность и энтузиазм вернулись в 2020-м — когда появился новый вирус, от которого срочно потребовалась вакцина. Все производители, по какой бы технологии они ни работали, оказались в равных условиях. Выяснилось, что за годы тишины BioNTech и Moderna узнали достаточно об мРНК-вакцинах, чтобы сразу обогнать конкурентов. Для создания препарата оказалось достаточно вирусного генома — тогда как для традиционных вакцин нужно было или размножать сам вирус, или учиться производить его белок, или упаковывать его РНК внутрь вектора. Правда, потом оказалось, что заставить клетки смириться с мРНК — это еще полбеды: гораздо сложнее заставить людей смириться с необходимостью прививаться.

Сейчас никто не может пожаловаться на отсутствие внимания к мРНК-вакцинам. За время пандемии их производители набрали огромную статистику — и по эффективности, и по безопасности — и переходят к новым инфекциям и болезням (а заодно возвращаются к старым). Moderna уже тестирует вакцину от ВИЧ в клинических испытаниях. А мРНК-терапией (которую сейчас не называют генной, чтобы не путать с ДНК-терапией) пробуют лечить рак и последствия инфаркта.

Мечты нобелиатов исполняются. Но какой ценой.