Как (и зачем) под Москвой корову клонировали

Когда в 1997 году ученые из Эдинбурга отчитывались о рождении овечки Долли (тогда еще «ягненка 6LL3»), то сразу предупредили: одним только клонированием дело не ограничится. 

Клон — это копия живого организма, которая получена безо всякого размножения и сопутствующих ему неудобств. Никаких ухаживаний и томлений сердца, никаких сперматозоидов и законов Менделя. Не нужно гадать, какие гены унаследует потомок и какие признаки селекционерам придется выводить заново. Люди в белых халатах просто забирают кучку клеток у оригинала и переносят их ядра в яйцеклетки, из которых потом вырастают копии. Столько, сколько этим людям нужно (ну, и сколько родов они готовы принять).

Но можно пойти и дальше. Если у нас нет на руках животного с нужными свойствами, можно взять клетки у обычного, подправить внутри них гены — и получить все необходимое уже в следующем поколении. Что, собственно, и проделали американские биологи уже через два года после рождения Долли, вырастив телят со встроенным в клетки ферментом бета-галактозидазой. Сам по себе этот белок телятам не нужен, он работает маркером: по его наличию можно проверить, что генетические изменения добрались до каждой клетки, — и показать тем самым, что методика рабочая. 

За двадцать пять лет генетики научились получать животных с разными свойствами, полезными для хозяйства. Появились безрогие коровы, «гуманизированные» свиньи (чьи органы можно пересаживать человеку, не рискуя вызвать иммунный ответ) и собаки повышенной выносливости и мускулистости. 

За такую работу взялись и в России — первые клонированные животные уже родились. Мы расспросили людей, которые работали над их созданием, о том, когда стоит ждать атаки клонов на российские луга — и каково это вообще, редактировать и клонировать коров.

Откуда берутся клоны

Через год после шотландской овечки, в 1998-м, японские ученые клонировали корову, еще через год — козу. Технология сработала для самых разных млекопитающих, и в 2006-м ее начали осваивать в Федеральном исследовательском центре животноводства имени Л. К. Эрнста (тогда еще Всероссийском институте животноводства, ВИЖ).

Сделать клона можно несколькими способами (мы рассказывали о них в материале «Здравствуй, гхола!»). Но самый популярный — тот, который опробовали на овечке Долли, — перенос ядер: при этом обычную соматическую клетку (с ядром) впрыскивают внутрь яйцеклетки (без ядра).

Этот метод, естественно, описан в каждой экспериментальной научной статье по клонированию. Но, по словам Галины Сингиной, заведующей лабораторией экспериментальной эмбриологии ФИЦ, фактический успех процедуры завязан на множество нюансов, которые в оригинальной статье не упомянуты. «Например, этап слияния, — объясняет исследовательница в интервью N + 1. — В литературе описываются только режим — сколько импульсов, какой силы, какой длины — и состав буфера, то есть раствора, в котором находятся клетки, и все. А какая у него, например, должна быть температура?»

Такого рода вопросов возникает множество на каждом этапе процедуры, и от ответов на них зависит, выживет ли зародыш — и, соответственно, сколько раз придется перенести фибробласт в яйцеклетку, прежде чем получится хотя бы один жизнеспособный эмбрион. Каждая ошибка еще сильнее снижает и без того невысокую эффективность клонирования — даже при хорошо отработанном протоколе удачных эмбрионов получается меньше десятка на сотню пересадок. 

Как и в любой другой методике, объясняет ученая, все может пойти не так, если просто забыть проверить фильтр для воды, сменить поставщика для какого-нибудь из реагентов или даже поручить процедуру другому сотруднику, — в пределах одной лаборатории при одном и том же протоколе у одного сотрудника клетки умирают чаще, а у другого реже.

Процедуру в Центре освоили быстро. Работы по клонированию начались в 2007-м, а первые клонированные эмбрионы свиней (начали именно с них), по словам собеседницы N + 1, появились уже через год.

В это же время американская FDA объявила, что есть мясо и пить молоко от клонированных коров, коз и свиней, — безопасно. В Европе в этом были не так уверены: регуляторы одобрили такие мясо и молоко условно — только если будет доказано, что они безвредны. В 2010-м выяснилось, что дети этих клонов все равно уже проникли на европейский рынок — поскольку биоматериал (в том числе сперму) от домашнего скота никто так тщательно не проверяет. Европейские регуляторы посовещались и заключили, что молоко и мясо, полученные от потомства заграничных клонов, не угрожают здоровью граждан, — но выращивать собственных клонов вне эксперимента все-таки запретили.

Российские клоны за это время так и не родились. Технологию отработали — и не пошли дальше. Почти десять лет ученые тренировались получать больше качественных эмбрионов, выверяли детали метода, отрабатывали его на крупном рогатом скоте. Попробовали было перенести эмбрионы суррогатным матерям-свиньям — но зародышей было всего 10 штук, и ни один не прижился. Добиваться рождения клонов не стали.

«Мы знали, что это умеем, и все, — говорит ученая. — Просто так пересаживать эмбрионы в животных — это дорого. Не было возможности, да и не целесообразно было содержать нужное количество коров для вынашивания клонов. Получать животное нужно под какие-то задачи». 

Задачи появились только в 2018 году, когда в моду вошла система редактирования генома CRISPR/Cas. Ее предшественники работали не очень эффективно, а поскольку само по себе клонирование тоже дает невысокий выход, то две процедуры подряд снижали шансы на успех почти до нуля. Появление CRISPR/Cas оживило угасший было интерес к клонированию и возродило надежду получить отредактированного клона с полезными свойствами «Мы поняли, — вспоминает ученая, — что  можем использовать нашу технологию с такой практической целью».

Как не убить яйцеклетку

Трансгенных животных, конечно, получали и до этого. Клонированных и отредактированных ягнят американцы показали еще в 1998-м, а в 2002-м в Китае родились первые гуманизированные свиньи. На поверхности их клеток было меньше остатков α-1,3-галактозы, на которые обычно остро реагирует иммунная система человека. То есть при пересадке человеку органы таких свиней не должны были вызвать сильного отторжения.

Но классические методы генетической модификации были не очень точными: можно было вырезать ген целиком или вставить новый, но не поменять какой-нибудь нуклеотид на другой или удалить маленький кусочек регуляторной последовательности. Поэтому, когда в начале 2010-х появились генные редакторы — TALEN и «цинковые пальцы», — ученые бросились перекраивать геномы домашнего скота по-новому. А потом открыли CRISPR/Cas9, и события начали развиваться еще быстрее. Ключевая работа по геноредакторам нового поколения вышла в 2012-м, человеческие клетки ими отредактировали в 2013-м, а еще через год родились первые CRISPR-модифицированные свинья, коза и корова.

В 2015 году генетической редактурой зародышей заинтересовался российский молекулярный биолог из МГУ Петр Сергиев. Резать ДНК в отдельных клетках с помощью CRISPR/Cas он научился быстро, но на то, чтобы получить первую отредактированную мышь, понадобилось куда больше времени. «Я узнал, что в России по сути есть [ровно] одна лаборатория, где делают генетические манипуляции с мышами. Много людей говорит, но немного делает, — вспоминает он. — Я пришел в Институт биологии гена и сказал, что хочу научиться. Меня там оформили стажером, несмотря на то, что в МГУ я профессор. Я год туда ходил, освоил эту кухню микроинъекции, и после этого организовал все это в МГУ».

Чтобы отредактировать зародыш, нужно взять оплодотворенную яйцеклетку и ввести в нее компоненты системы CRISPR/Cas. И здесь тоже все решают нюансы.

«Почему нужен год, чтобы научиться? — объясняет Сергиев, — Важно набить руку. Первый тонкий момент в процедуре микроинъекции — научиться ее делать так, чтобы проткнутая яйцеклетка не померла». Дело в том, что прокалывать нужно две оболочки сразу: внешнюю оболочку (это толстый слой белков и углеводов, который защищает зиготу от проникновения лишних сперматозоидов) и собственную мембрану клетки. Причем вторая оболочка оказывается гораздо упорнее. «Как очень подвижная резиночка, — говорит Сергиев. — Как если вы карандаш в резиновый шарик вводите, он пружинит и просто вынимается, как он есть. Вот такое забавное механическое свойство яйцеклетки».

Прокол делают обычно с помощью стеклянного капилляра, который в лаборатории Сергиева готовят вручную. Но оказалось, что самые тонкие и безопасные капилляры очень быстро забиваются обычной пылью. Поэтому приходится делать трубочки потолще — а они уже часто травмируют яйцеклетки.

На этом трудности не заканчиваются. Дальше молекулярному биологу, который решит вырастить отредактированную мышь, предстоит пересаживать зиготы в организм суррогатной матери. А это отдельное приключение. 

«Мышь под наркозом, — описывает процесс Сергиев, — ей делают разрез сбоку, достают яичник. И [вводят зиготу] в яйцевод капиллярчиком. Это руками делается: человек держит импровизированный шланг, на конце которого капиллярчик, а в капиллярчике на конце раствор с яйцеклетками. И их надо туда вдуть. То есть второй конец этого резинового шланга во рту экспериментатора. Этому тоже надо примерно год учиться, чтобы руку набить. Потому что мышь же живая. Хоть она и под наркозом, но у нее там все шевелится».

Но если использовать CRISPR/Cas в сочетании с клонированием, этих трудностей можно избежать. Достаточно сначала отредактировать какие-нибудь соматические клетки, например, те же фибробласты, а потом перенести их ядро в яйцеклетку — и не придется мучаться с прокалыванием ее оболочки.

К 2018 году в Японии научились таким образом исправлять рецессивные мутации у скота, а в Китае получили коров с повышенной устойчивостью к туберкулезу. Тогда и в России решили вернуться к давно забытому клонированию и довести эксперимент до конца — чтобы получить трансгенную корову.

Как починить корову

«На собрании, посвященном генному редактированию, — вспоминает Сергиев, — [мы] встретились с Зиновьевой, директором ВИЖ. И решили, что вот у них есть опыт пересадки ядер, а у нас есть опыт работы с мышами. У нас есть опыт создания конструкции для редактирования, а у ВИЖ есть опыт работы с хозяйственными животными. И почему бы нам не объединиться?»

Работать начали параллельно. Сергиев и его группа должны были создать генетическую конструкцию — а для этого нужно понять, что именно редактировать и как.

«Прогресс в этой области, — рассказывает ученый, — довольно сильно сдерживает то, что не очень понятно, что именно редактировать, чтобы улучшить свойства. Вариантов [генов, которые можно было бы исправить с пользой для сельского хозяйства, без вреда для животного и без риска для потребителя] не так уж и много». 

Исследователи задумались было про корову, которая давала бы безлактозное молоко, — чтобы его могли пить люди с непереносимостью лактозы. Но оказалось, что это невозможно чисто технически. «Лактоза формирует объем молока, — объясняет Сергиев. — Вода стремится разбавить раствор лактозы. Если выключить синтез лактозы — что возможно — просто молока не будет, не будет объема». 

Ученые решили сделать коров, молоко у которых не содержало бы лактоглобулина — основного молочного антигена. Его могли бы пить люди с аллергией на коровье молоко (хотя оно и не помогло бы людям с непереносимостью лактозы). Таких коров и коз уже пытались вывести в других странах. Правда, эта задача оказалась посложнее обычного нокаута: за производство лактоглобулина отвечают сразу два гена (и каждого в клетке, естественно, по две копии), поэтому фактически нужно вырезать четыре участка коровьего генома.

Как родить клона

Тем временем эмбриологи достали с полки свою технологию клонирования и взялись проверять, работает ли она на самом деле. В 2018 году в Центре животноводства снова начали получать эмбрионы — на этот раз уже коровьи — а потом подсаживать их телкам-реципиентам. Таких пересадок понадобилось 31, чтобы 14 коров забеременели. В итоге в 2020 году на свет появился один клон — телка, которую назвали Цветочек.

«Так как это был первый опыт, — вспоминает исследовательница, — мы не знали, как будет проходить стельность, родится он сам или нам придется извлекать плод хирургически. А как мы будем [это] делать? Наши специалисты на таком крупном животном раньше этого не делали. Это был, конечно, стресс еще тот». 

Многие клоны гибнут прямо во время родов и сразу после — это произошло с сестрами овечки Долли и нередко происходит до сих пор. Часто плод развивается слишком большим (считается, что это особенный синдром, характерный для искусственно зачатых зародышей скота), и это может вызвать осложнения при родах. Так вышло и с Цветочком: суррогатная мать-корова вынашивала ее на 20 дней дольше положенного, и клон появился на свет 63-килограммовым (это как минимум в полтора-два раза больше нормы). 

А в остальном, уверена ученая, с Цветочком им очень повезло. Она быстро росла и ничем не болела. «Конечно, за ней был очень серьезный уход. Вся посуда, из которой она пила, все кипятилось, как ребенку». Никаких отклонений — ни физиологических, ни биохимических — ветеринары у нее не нашли: «Она уже к году была почти 400 кило, хорошо всегда ела. Вовремя сено начала есть, очень любила комбикорм и вела себя, как обычный теленок. Единственное — мы знали, что она клонированная, вот и все». 

Пока Цветочек училась есть сено, ветеринары присматривались к тому, что у нее происходит с репродуктивной системой. Там все оказалось в порядке, и когда Цветочку исполнилось почти два года, ученые решили ее осеменить — чтобы убедиться в том, что их первый клон не только жизнеспособный, но и фертильный. 

В конце 2022 года Цветочек родила Декабристку — самого обычного теленка, который, тем не менее, самим фактом своего рождения подтвердил, что его мать полностью здорова. И в этот раз роды прошли без проблем. «Мы пришли на плановый осмотр, — говорит исследовательница, — а теленок уже был».

А за то время, что Цветочек ходила стельной, в мире трансгенных коров произошло важное изменение: FDA впервые разрешила использовать отредактированных коров в сельском хозяйстве. Одобрение досталось животным породы красный ангус от компании Recombinetics — им генетики подарили укороченную шерсть, чтобы коровы меньше перегревались. Ожидается, что потомки этих коров унаследуют мутацию и будут лучше переносить жару и реже гибнуть — а их мясо доберется до прилавков.

Когда ждать ГМО

За это время группа Сергиева отработала свою технологию на фибробластах коровы. Пока удалось выключить три копии гена из четырех, но этого, в общем, достаточно. «Просто это займет два скрещивания, — объясняет ученый. — Первая коровка будет содержать один аллель. Потом ее нужно будет скрестить с диким типом (коровой без мутации — N + 1), будет, соответственно гетерозигота. Потом гетерозигот нужно будет скрестить друг с другом, и получится полный нокаут».

Параллельно исследователи разрабатывают генетическую конструкцию для других объектов: овец и кур. У овец, например, они планируют отключить ген миостатина — сигнальной молекулы, которая тормозит мышечный рост. С помощью такого нокаута в свое время в Китае сделали мускулистых собак.

В Центре тоже начали работу на овцах. Их клонировать удалось гораздо быстрее, чем коров: получать эмбрионы начали сразу после рождения Цветочка, а уже весной 2022-го появился первый клон, ягненок Конгур. Это значит, что технология клонирования — рабочая, и можно совмещать ее с редактированием.

Сейчас в Центре готовятся получить первую отредактированную корову. Но она не будет родственницей Цветочка, потому что донором ядра станет другая линия клеток — которую легче размножать.

После того, как в клетки ввели CRISPR/Cas9, объясняет собеседница N + 1, каждую клетку нужно выращивать отдельно — потому что неизвестно, в какой из них молекулярные ножницы сработают правильно. Потом каждая из клеток должна вырасти в колонию. «При этом до колоний вырастает лишь часть клеток, так как не все они способны расти в одиночестве. В нашем случае таких клеток бывает от 25 до 30 процентов».

Дальше полученные колонии нужно проверить, чтобы найти ту, в которое редактирование произошло. А потом ее уже размножать. Поэтому каждому фибробласту приходится много раз поделиться, прежде чем он получит шанс слиться с яйцеклеткой. И гораздо удобнее здесь использовать клетки не взрослых животных, а плодов. 

Сейчас на руках у эмбриологов уже есть готовые эмбрионы коров, отредактированные и клонированные. В течение года ученые планируют начать их пересаживать суррогатным матерям — но не раньше осени, потому что параллельно идет работа на овцах. Это значит, что первая отредактированная корова родится не раньше, чем в следующем году.

Но точных прогнозов ученая не дает: «Неизвестно, как такие эмбрионы себя поведут, и сколько нужно сделать пересадок. Чтобы родился Цветочек, потребовалось 30 пересадок. Здесь может понадобиться [еще] больше, чтобы получить одно потомство». А о линии коров, по ее словам, вообще думать рано: «Сейчас мы не можем так далеко планировать. Животное девять месяцев только беременное ходит, это не мышка».

С мышками, правда, как объясняет Сергиев, все тоже не так просто. Вот с бактериями, говорит он, действительно быстро: «Генетическую манипуляцию сделал — и на следующий день подросли колонии, и ты, по крайней мере, узнаешь, получилось или нет. А с мышами сделал эксперимент — и [только] через 2 месяца понял, что не получилось. А иногда и больше».

Но даже если родилась мышь с нужной мутацией, вывести из нее линию быстро не получится. «Мыши же люди свободные, — говорит Сергиев, — они могут и не размножаться. Вот ждешь потомства, а она не хочет плодиться полгода, например. В некоторых случаях создание линии мышей, то есть не просто исходной мыши отдельной, а именно линии стабильной, чтобы мышей [было] много, [можно было] эксперименты ставить, это занимает несколько лет. Представляете, что там с коровами?» 

А будет ли стадо

С коровами, даже если первый опыт пройдет успешно, предстоит еще немало работы, чтобы получить полноценную линию. Если такая задача когда-нибудь возникнет, объясняет исследовательница, на следующем этапе нужно будет получить двух животных — разного пола, и желательно из разных линий, чтобы их можно было скрещивать, не опасаясь инбридинга. Потом их можно клонировать (уже не редактируя), а потом скрещивать между собой. На это, по словам ученой, может уйти не меньше 5-10 лет: «Это очень сложная история, то есть [нельзя] говорить о том, что там что-то сейчас быстро пастись начнет».

К тому же, прямо сейчас отредактированным клонам мешает пастись российское законодательство. В России запрещено разводить генетически модифицированный скот, а редактура с помощью CRISPR/Cas9 пока официально не отделена от классических методов генной модификации. Так что в исследовательских целях корову получить, конечно, можно, но чтобы вывести ее молоко или мясо на рынок, понадобится вносить поправки в закон.  

Да и в остальном мире отредактированные клоны пока не ходят стадами. В чистом виде клонирование используют только для того, чтобы скопировать самых «удачных» особей — и дальше разводить породу естественным путем. А клонирование в связке с редактированием практически нигде еще не одобрено к применению.

Даже в США сейчас разрешено использовать только два вида млекопитающих. Это, во-первых, свиньи без бетагалактозидазы. В прошлом году сердце такой свиньи пересадили пациенту — и это пока единичный случай. А во-вторых, короткошерстные коровы. Но и здесь о стаде речи еще не идет: одобрение FDA распространяется на двух конкретных особей, которых создатели предъявили ведомству, — и их потомков, когда они появятся на свет.

Наконец, не все согласны с тем, что размножать таких клонов действительно необходимо. Как говорила весной 2022 года директор Центра Наталья Зиновьева, редактировать домашний скот имеет смысл не для того, чтобы сделать его более продуктивным — этого можно добиться и с помощью обычной селекции, — а чтобы придать ему какие-то принципиально новые свойства. Например, выработать устойчивость к какой-нибудь инфекции. Или сделать органы животных пригодными для пересадки людям. Или вовсе превратить их в биореакторы для производства каких-нибудь терапевтических молекул.

Дирекция Центра не ответила N + 1 на вопрос о том, планируют ли в Центре выводить линию отредактированных коров без лактоглобулина. А других разработок и клонов с новыми свойствами у российских животноводов пока нет. Так что гипоаллергенная корова, когда и если она появится, может так и остаться невостребованной в сельском хозяйстве и единственной в своем роде. На память о том, что в России сумели клонировать и отредактировать корову.