С индивидуальным наведением

Терапия рака до сих пор надежно покоится на трех китах — хирургии, лучевой и химиотерапии, за десятки лет успевших неплохо себя зарекомендовать. Тем не менее, рак — «болезнь генома», и порой знания о молекулярных особенностях конкретного новообразования помогают назначить лечение там, где стандартные методы оказались бессильны. На сегодняшний день на рынке представлены десятки препаратов, воздействующих на конкретную мишень в раковой клетке. Однако, как показала практика, они подходят далеко не всем пациентам, и их назначение зачастую зависит не от того, какой орган поражен, а от наличия в опухоли конкретных мутаций. Подробнее о том, как секвенирование ДНК применяется для подбора лекарств, рассказываем в нашем материале.

Случайное открытие

В 2002 году на страницах престижного журнала Lancet Oncology развернулась дискуссия вокруг нового препарата «Иресса» (Iressa), неплохо показавшего себя в клинических испытаниях против немелкоклеточного рака легкого.

Дело в том, что широкомасштабное применение в третьей фазе испытаний не только поставило под сомнение эффективность препарата, но и дало повод усомниться в безопасности его применения.

В Японии онкологи стали широко назначать «Ирессу» пациентам с таким диагнозом и обнаружили, что в редких случаях препарат не просто не помогает, а провоцирует преждевременную смерть больных. В некоторых же случаях он помогал очень хорошо и в комбинации с химиотерапией приводил к полному исчезновению опухоли.

Тайна «Ирессы» — препарата, подавляющего рост опухоли за счет блокирования рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), — разрешилась при помощи генетиков. Выяснилось, что лекарство работает только против тех опухолей, у которых есть мутации в гене EGFR, приводящие к усилению экспрессии рецептора.

Дальнейшие исследования показали, что соответствующие мутации обнаруживаются у 10-30 процентов пациентов с немелкоклеточным раком легкого — самого распространенного типа рака легких. В 2009 году тест на мутации в EGFR был рекомендован к клиническому применению, и в настоящее время всегда используется перед назначением препаратов-ингибиторов EGFR.

Почти случайное открытие в каком-то смысле дало толчок развитию генетических исследований в практической онкологии. К моменту одобрения теста на EGFR на рынке было уже более десятка так называемых таргетных препаратов, которые, в противоположность химиотерапии, действующей на все делящиеся клетки без разбора, были нацелены на одну конкретную мишень в опухолевой клетке.

Так случай с «Ирессой» помог понять: прежде чем «стрелять по мишени», необходимо посмотреть на нее и убедиться, что она на месте.

Две мутации и более

Молекулярные исследования рака насчитывают уже почти полвека, и за это время ученым удалось обнаружить основные уязвимые места клетки, поломки в которых приводят к неконтролируемому росту и развитию злокачественной опухоли.

Несмотря на то, что количество мутаций в раковых клетках может достигать тысяч, в каждой опухоли можно выделить ряд ключевых изменений, без которых она не смогла бы появиться. Зачастую это мутации в генах, кодирующих белки сигнальных каскадов — путей передачи сообщений от периферии к командному центру, то есть к ядру.

Такие гены называются онкогенами. Постоянная ложная активация сигнальных каскадов заставляет клетку делиться, когда в этом нет необходимости.

Упомянутый выше рецептор фактора роста EGFR как раз представляет собой один из хорошо изученных онкогенов, а ингибиторы этого семейства белков стали одними из первых таргетных препаратов, появившихся в клинической практике.

Связывание фактора роста с рецептором активирует следующий сигнальный путь, который зависит от белков семейства Ras. Постоянная активация Ras также приводит к злокачественной трансформации клеток.

Оказалось, что при наличии активирующей мутации в гене KRAS, кодирующем один из Ras-белков, подавление экспрессии EGFR бесполезно — клетки все равно бесперерывно получают сигнал о том, что надо делиться. Это открытие частично объяснило, почему терапия «Ирессой» при наличии мутации в EGFR приводит к успеху в лучшем случае в 90 процентов случаев, а зачастую и реже.

В случае немелкоклеточного рака легкого мутация в KRAS обнаруживается у 15-30 процентов пациентов. В случае пациентов с метастатическим колоректальным раком, который тоже лечат ингибиторами EGFR, эти мутации можно найти почти в 40 процентах опухолей.

Получается, что для эффективного назначения таргетной терапии нужно проверять опухоль как минимум на две мутации. Однако в реальности таких мутаций может быть больше.

Исследования биологии опухолей позволили выделить ключевые особенности, делающие опухоль бессмертной. Кроме постоянной активации сигнальных каскадов, это нечувствительность к сигналам «торможения», избегание апоптоза, постоянная активация роста сосудов, способность к метастазированию.

Все эти «суперспособности» обеспечиваются за счет удачных мутаций в тех или иных генах. Таким образом, для максимально успешной терапии врачу в идеале нужно видеть весь генетический портрет опухоли — и не просто видеть, а разобраться в нем.

Полный геном опухоли

В случае одного гена анализ на наличие мутаций сделать не так сложно — из образца опухоли выделяют ДНК, при помощи полимеразной цепной реакции многократно размножают нужный фрагмент и затем с помощью доступного и дешевого секвенирования по Сэнгеру определяют последовательность гена, чтобы сравнивать его со здоровым контролем.

Это можно сделать практически в любой диагностической лаборатории, и все крупные онкоцентры выполняют такие исследования.

В России подобные тесты не покрываются обязательным медицинским страхованием, но, к примеру, Российское общество клинической онкологии бесплатно реализует исследования на наличие отдельных мутаций для пациентов и врачей в рамках национальной программы «Совершенствование молекулярно-генетической диагностики с целью повышения эффективности противоопухолевого лечения».

Однако в тех случаях, когда генетики не знают, что именно надо искать, приходится полностью определять последовательность опухолевого генома при помощи секвенирования следующего поколения (NGS). (Получить представление о технологиях высокопроизводительного секвенирования ДНК можно здесь).

В 2014 году сотрудник корпорации Intel Брюс Олсон (Bryce Olson) узнал, что у него рак предстательной железы на последней стадии. Когда после операции и шести раундов химиотерапии он так и не пошел на поправку, Брюс воспользовался своими связями в отделе наук о жизни Intel и нашел возможность полностью отсеквенировать геном опухоли.

Так он узнал о наличии мутаций в генах Pi3K и PTEN, продукты которых работают в тех же сигнальных каскадах и заставляют клетки неконтролируемо делиться. К сожалению, в клинической практике врачей еще не было подходящих таргетных препаратов. Зато препарат-ингибитор Pi3K проходил клинические испытания.

Несмотря на то, что набор пациентов был уже закрыт, Брюс дозвонился до руководителя исследования и настоял на необходимости своего участия в исследовании, ссылаясь на полученные сведения о молекулярных особенностях своей опухоли.

Брюсу повезло — терапия новым препаратом помогла ему пойти на поправку. После этого Олсон основал общество Sequence Me, занимающееся информированием пациентов о дополнительных возможностях лечения в тех случаях, когда стандартная терапия не помогла.

Метод онкопанелей

В последние годы развитие технологий значительно удешевило определение последовательности ДНК, однако это все равно еще достаточно дорого. Есть более дешевые варианты: секвенирование экзома, то есть только кодирующих частей генов, или поиск самых распространенных опухоль-ассоциированных мутаций при помощи гибридизации ДНК. Однако эти методы не дают полной картины.

Неким компромиссом является так называемое геномное профилирование опухоли, которое заключается в секвенировании только ключевых онкогенов. Один из первых таких тестов, получивших название онкопанелей, разработал Институт рака Слоан Кеттеринг в Нью-Йорке.

В 2017 году этот тест под названием MSK-IMPACT, включающий направленное определение последовательности для 468 генов, был одобрен американской администрацией по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) для применения в клинике.

Онкопанель от Foundation Medicine, также одобренная FDA, включает «всего» 324 гена. Эта панель применяется в клинической практике для тестирования пациентов с поздними стадиями рака вне зависимости от типа опухоли.

В США такой тест стоит несколько тысяч долларов, а в Швейцарии, например, покрывается медицинской страховкой. В Университетской больнице Цюриха в 2019 году сделали более 900 тестов.

Анализ опухоли в лаборатории молекулярного профилирования Университетской больницы Цюриха проводится так. На первом этапе врач-патоморфолог анализирует образец пациента под микроскопом и выбирает самый «подозрительный» участок опухоли, который отправят на секвенирование.

Затем из микроскопического кусочка ткани выделяют ДНК и разрушают ее на кусочки. Фрагментированную ДНК смешивают с магнитными шариками, на которые «пришиты» одноцепочечные кусочки генов, выбранных для исследования. ДНК из образца пациента «прилипает» к цепочкам на магнитных шариках.

Затем при помощи магнита шарики с выловленными нужными фрагментами ДНК изолируют из смеси. Таким образом удается выделить из образца пациента только те гены, которые необходимо проанализировать.

Из полученной ДНК готовят так называемые библиотеки для секвенирования, а затем наносят их на небольшой чип, похожий на предметное стекло микроскопа. Чип содержит невидимые глазу ячейки, в которых и происходит определение последовательности путем синтеза по технологии, разработанной компанией Illumina.

Высокопроизводительный секвенатор HiSeq2500 позволяет анализировать ДНК сразу нескольких пациентов. Тем не менее, весь анализ занимает две недели. Он включает интерпретацию полученных данных. Отчет анализируется как онкологом, так и врачом-генетиком.

По оценкам сотрудников лаборатории, профилирование помогло назначить лекарство примерно четверти больных, чьи опухоли были проанализированы.

Когда это оправданно?

По оценкам профессора Дэвида Томаса, руководителя онкологического подразделения Института Гарвана и директора исследовательского центра Кингхорн в Сиднее (Австралия), геномное профилирование опухоли может помочь назначить новое лекарство примерно пятой части всех пациентов со всеми типами рака. Его имеет смысл делать больным с продвинутыми стадиями заболевания, которым уже не помогли стандартные линии терапии.

Кроме того, по мнению Томаса, имеет смысл генотипировать пациентов на любой стадии с некоторыми типами рака, для которых связь с конкретными мутациями уже хорошо подтверждена — как в случае рака легкого.

Конечно, секвенирование генома опухоли это далеко не гарантия положительного исхода для пациента. По признанию профессора Томаса, из нескольких сотен генов, входящих в онкопанель, реальную клиническую значимость имеют от силы 30.

Кроме того, далеко не для всех известных мутаций на сегодняшний день существуют таргетные препараты. Доктор Томас признает, что зачастую врачи дают пациентам ложную надежду, назначая такие анализы.

Тем не менее, отсутствие мутаций тоже результат — он поможет принять решение и не назначить таргетный препарат, курс которого может стоить очень дорого.

Руководитель геномного центра Сеченовского университета и директор по науке компании Oncobox Антон Буздин приводит оценки, согласно которым анализ мутаций посредством генетических онкопанелей в 80-90 процентах случаев не позволяет врачу сделать выбор конкретной тактики лечения.

Как считает Буздин, гораздо эффективнее проводить полное молекулярное профилирование опухоли, включая этапы экзомного секвенирования (всех кодирующих белки генов), транскриптомного секвенирования (показывающего, какие именно гены экспрессированы в опухоли) и биоинформатическую обработку данных, включающую этап анализа активности сигнальных путей раковых клеток.

Лишь в этом случае отчет даст ответ о целесообразности назначения всех таргетных препаратов, а не малой их части, как в случае с чисто геномными анализами.

Многоуровневое комплексное исследование целесообразно, когда стандартные схемы лечения пациента не дали результатов, а также если нужно сделать выбор между несколькими альтернативными вариантами терапии.

По оценке Буздина, затраты на тестирование обычно в 10-40 раз меньше, чем на курс терапии, эмпирически подобранный онкологом, но в итоге не вызвавший стабилизации или регресса опухоли. Чаще всего молекулярное профилирование используют для пациентов на третьей и четвертой стадии рака, когда все остальные методы уже испробованы.

Накопление данных о мутациях и экспрессии генов и отслеживание ответа на лечение в зависимости от конкретного набора активных мишеней позволяет биоинформатикам строить математические модели и предсказывать эффективность таргетных препаратов для различных групп онкопациентов. Клинические испытания подтверждают обоснованность подобных прогнозов.

Так, в исследовании WINTHER данные по экспрессии помогли назначить дополнительное лечение для трети (107 из 303) пациентов с поздними стадиями рака, которые уже не отвечали на курсы стандартной терапии.

В России проводятся схожие клинические испытания. Одно из них стартовало в 2018 году и завершится к концу 2020-го. Со слов Буздина, по предварительным результатам эффективность лечения, подобранного на основе анализа экспрессии генов в опухоли по уровню мРНК (55 процентов) вдвое превосходит показатели эмпирически подобранной терапии (около 30 процентов).

Наконец, генетические исследования опухолей важны для пациентов с так называемыми карциномами с неустановленным первичным очагом (CUP – carcinoma of unknown primary origin). Такие опухоли, диагностируемые в виде метастазов, встречаются примерно у каждого 15-го онкобольного, и зачастую у них плохой прогноз.

Согласно данным Европейского общества медицинской онкологии, треть пациентов с таким диагнозом не отвечают на стандартную химиотерапию, однако им можно было бы назначить таргетную или иммунотерапию.

Целью исследования CUPISCO, инициированного Roche и Foundation Medicine, является сравнение эффективности таргетной терапии, назначенной на основании геномного профилирования опухоли, по сравнению со стандартной химиотерапией у пациентов с CUP.

Спасение или хайп?

Онкогематолог, заместитель директора Национального медицинского исследовательского центра имени Дмитрия Рогачева Михаил Масчан подтверждает, что молекулярное профилирование опухолей все больше входит в клиническую практику врачей, а удешевление технологий секвенирования делает этот этап неизбежным. «Это дорога, по которой мы идем», — признает доктор.

Однако Масчан подчеркивает, что интерпретация данных и клинические решения должны обосновываться на клинических испытаниях, как и в случае с любой другой медицинской технологией.

Клинические испытания, в которых таргетные препараты и их комбинации назначались бы в зависимости от данных расширенного молекулярного анализа опухоли, только набирают обороты. В этом смысле производители онкопанелей, рекламирующие их как медицинскую услугу, несколько опережают события и раздражают практикующих врачей.

Однако здесь кроется системная проблема. «Цена клинического испытания может на порядки превышать стоимость разработки препарата, — комментирует Михаил Масчан. — А чтобы сделать молекулярное профилирование стандартной практикой в онкологии, нужно вложить огромные средства в клинические исследования комбинаций препаратов».

Кто должен этим заниматься, непонятно, но пока инициатива исходит в основном от самих производителей услуг секвенирования.

К тому же, хотя множество исследователей и онкологов признают, что для в некоторых случаях лечение, назначенное на основе геномных данных, творит чудеса, отдельные специалисты считают, что значимость как генетики, так и таргетной терапии неоправданно раздута.

В 2018 году журнал Science опубликовал материалы дискуссию, развернувшейся во время конференции Американской Ассоциации исследователей рака.

Так, исследователь Винай Прасад из Университета здоровья Орегона (США) привел следующие данные. В 2018 году в США из 600 тысяч пациентов с поздними метастатическими стадиями рака лишь 15 процентов подходили под назначение той или иной таргетной терапии. Тем не менее, поскольку опухоль не всегда отвечает на препарат, в реальности менее семи процентов этих пациентов получили бы пользу от терапии, не исключающей, к тому же, рецидивов заболевания за счет эволюции опухоли.

Кроме того, Прасад выразил обеспокоенность тем, что по результатам генетических тестов врачи начнут назначать «плохие лекарства» — соответствующие мутации, но не проверенные в клинических испытаниях против данного типа рака.

Участники дискуссии сошлись на том, что генетические исследования в онкологии — это все же не «хайп», но необходиом провести еще множество испытаний, основанных на молекулярном профилировании опухолей. Так как, согласно недавнему

, половина новых препаратов от рака в реальности не работают, возможно именно новые схемы их назначения сделают терапию более эффективной.

Дарья Спасская
(Статья подготовлена с использованием материалов пресс-тура The Future of Personalised Healthcare: Advances in Precision Medicine and Genomics, организованного компанией Roche)