Бета-амилоиды на эритроцитах снизили сродство к кислороду путем подавления НАДФН-оксидазы

Российские и швейцарские исследователи провели серию экспериментов на клеточных культурах и мышах и выяснили, что ключевые пептиды патогенеза болезни Альцгеймера — бета-амилоид и его изоформа — снижают кислородтранспортную функцию эритроцитов. Это происходит из-за снижения сродства гемоглобина к кислороду и высвобождения кислорода эритроцитами, преимущественно за счет снижения активности НАДФН-оксидазы, рассказали N + 1 в пресс-службе Института молекулярной биологии РАН. Статья опубликована в журнале Cell Death Discovery.

Циркуляция патогенных форм бета-амилоида, в первую очередь из 42 аминокислотных остатков (Aβ42) сопровождает развитие болезни Альцгеймера, а формирование отложений Aβ42 и его изоформы с изомеризованной аспарагиновой кислотой в седьмом положении (isoAβ42) играют важную роль в патогенезе заболевания. Отложения Aβ42 в сосудах вызывают их дегенерацию и нарушения кровообращения. Снижение уровня кислорода в мозговых венах при болезни Альцгеймера прогрессирующе уменьшается, что коррелирует со снижением когнитивных функций, точные причины этой гипоксии остаются неуточненными. При этом известно, что основными переносчиками бета-амилоида в крови служат эритроциты, уровень Aβ42 на их поверхности значительно выше, чем в плазме.

Ирина Петрушанко (Irina Petrushanko) из Института молекулярной биологии имени Энгельгардта РАН и ее коллеги инкубировали человеческие эритроциты, окрашенные флуоресцентными антителами к бета-амилоиду, с возрастающими концентрациями Aβ42 и isoAβ42. Оказалось, что эти пептиды связываются с мембранами клеток со схожей аффинностью (константы диссоциации 0,99 и 1,01 микромоля). Ферментативное удаление сиаловых кислот гликокаликса повышало их связывание с эритроцитами. При инкубации эритроцитов с растворами Aβ42 или isoAβ42 повышалось парциальное давление кислорода при 50-процентном насыщении гемоглобина (p50), то есть сродство гемоглобина к кислороду уменьшалось. Мониторинг в реальном времени показал, что инкубация с этими пептидами также снижала высвобождение кислорода из эритроцитов, и это сопровождалось изменениями формы, но не размеров клеток.

Анализ S-глутатионилирования цистеинов гемоглобина (модификации, в разы повышающей сродство к кислороду) показал, что она снижалась под действием Aβ42, но не isoAβ42. Поскольку глутатионилирование гемоглобина служит реакцией на окислительный стресс, исследователи с помощью флуоресцентного маркера оценили внутриклеточный уровень активных форм кислорода и выяснили, что и Aβ42, и isoAβ42 существенно его снижали. Анализ окислительно-восстановительного статуса эритроцитов показал, что под действием этих пептидов повышается уровень антиоксиданта глутатиона, но не других тиолов, а уровень оксида азота (NO) снижается под действием isoAβ42, но не Aβ42. Характеризация уровня активных форм кислорода в эритроцитах мышей с моделью болезни Альцгеймера (APP/PS1) подтвердила, что он отрицательно коррелирует с количеством амилоида на поверхности клеток у них, но не у здоровых животных.

Поскольку одним из источников активных форм кислорода в эритроцитах служат НАДФН-оксидазы семейства NOX, авторы работы провели эксперименты с их ингибитором дифенилйодонием (DPI). Его присутствие более чем на четверть снижало уровень окислительных эквивалентов в клетках и полностью ликвидировало эффекты Aβ42 и isoAβ42, включая изменения p50. Присутствие бета-амилоида, особенно isoAβ42, замедляло расщепление НАДФН сопоставимо с действием DPI, и его действие на NOX не зависело от изменений уровня ионов кальция. Анализ вторичной структуры гемоглобина спектроскопией кругового дихроизма показал, что и действие бета-амилоидов, и ингибирование NOX снижают содержание в нем альфа-спиралей примерно на 10 процентов. Добавление бета-амилоидов к ингибитору NOX не усиливало этот эффект, что свидетельствует об их аналогичном действии на гемоглобин. Вдобавок к этому isoAβ42, но не Aβ42 снижал долю гемов с высоким сродством к кислороду.

В завершение исследователи провели количественный анализ isoAβ в растворимой в мочевине фракции мозга мышей с моделью болезни Альцгеймера. Он показал, что доля этого пептида в общем содержании бета-амилоида была стабильна у таких животных и составляла от 11,6 до 13,5 процента. Также выяснилось, что доля эритроцитов с повышенным содержанием isoAβ отрицательно коррелирует с уровнем этого пептида в мозге (r Пирсона 0,72; p = 0,04). В сумме этой указывает на взаимообмен между мозговым и эритроцитарным пулами isoAβ.

Полученные данные свидетельствуют о том, что повышенное связывание бета-амилоидов снижает сродство гемоглобина к кислороду и замедляет высвобождение кислорода из эритроцитов в условиях уменьшения внутриклеточного уровня активных форм кислорода. Связывание Aβ42 снижает глутатионилирование гемоглобина и содержание в нем альфа-спиралей, а isoAβ42 — уровень NO и долю гемов с высоким сродством к кислороду. Ингибирование НАДФН-оксидазы нивелирует эти эффекты бета-амилоидов, а значит, вероятно, их действие на сродство эритроцитов к кислороду связано преимущественно с подавлением активности этого фермента. Это может быть потенциальным механизмом снижения сатурации крови при болезни Альцгеймера.

Ранее американские исследователи в экспериментах на клеточных культурах показали, что холестерин повышает связь предшественника бета-амилоида с ферментами, которые превращают его в бета-амилоид. Блокирование продукции холестерина в астроцитах мышей снижало бета-амилоида в их мозге практически до уровня здоровых животных.