В них сохранились структуры размером 50 нанометров
Австралийские, американские, датские, испанские, норвежские, российские и шведские исследователи применили современные молекулярно-биологические методы для анализа хорошо сохранившихся в вечной мерзлоте останков мамонта возрастом 52 тысячи лет. Им удалось полностью реконструировать геном и трехмерную структуру хромосом с нанометровым разрешением в клетках кожи, включая информацию об активных и неактивных участках. Это значительно превосходит по уровню детализации все предыдущие попытки анализа древней ДНК. Отчет о работе опубликован в журнале Cell.
Как правило, древняя ДНК в ископаемых останках людей, животных, растений и микроорганизмов представлена множеством небольших фрагментов, зачастую загрязненных примесью чужеродного генетического материала. Их подвергают полногеномному секвенированию, а затем картируют полученные короткие последовательности с помощью референсных геномов современных родственных организмов. Так удается выявить однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) и небольшие инсерции и делеции (инделы), но не более масштабные изменения, такие как хромосомные перестановки. Это дает ценную информацию для филогенетических и популяционных исследований организмов возрастом до более чем миллиона лет, но полного представления об устройстве генетического материала не дает.
Образцы кожи, с которыми работала Марселла Сандовал-Веласко (Marcela Sandoval-Velasco) из Копенгагенского университета с коллегами из Австралии, Дании, Испании, Норвегии, России, США и Швеции, были забраны из останков самки шерстистого мамонта (Mammuthus primigenius), найденных недалеко от поселка городского типа Белая Гора в Якутии. Радиоуглеродное датирование определило их возраст как более 45 тысяч лет, анализ митохондриальной ДНК указал на 52 тысячи лет. Гистологическое исследование показало, что морфология кожи хорошо сохранена — различимы базальный слой, дерма, волосяные луковицы и подлежащие мышцы, в клетках определяются ядра. Результаты обычного анализа древней ДНК из этих образцов были опубликованы ранее.
Исследователи применили для анализа образцов метод определения конформации хромосом Hi-C, модифицированный для выполнения этой задачи и названный PaleoHi-C. В ходе 26 экспериментов было прочитано в сумме почти 4,5 миллиарда пар оснований ДНК. После этого с помощью in situ Hi-C были получены de novo на хромосомном уровне геномные сборки африканского (Loxodonta africana) и азиатского (Elephas maximus) для сравнительного анализа с геномом мамонта. Этот анализ позволил отсеять примеси чужеродной ДНК, получить и верифицировать геномную сборку мамонта, а также определить в ней около 4,6 миллиона контактов удаленных участков ДНК внутри одной хромосомы и между разными, которые обусловлены трехмерной структурой хроматина.
Для восстановления трехмерной структуры генома авторы работы разработали метод, который опирается на структуру генома родственного вида и подтвердили его эффективность, успешно собрав de novo геном осла (Equus asinus) с помощью генома лошади (Equus caballus). Он позволил реконструировать генетический материал мамонта, состоящий, как и у современных слонов, из 28 хромосом и содержащий в сумме 3,04 миллиарда пар оснований. Дальнейшее сопоставление показало, что в образце кожи сохранились хромосомные территории, компартменты, петли, тельца Барра, а также и супердомены инактивированной Х-хромосомы и DXZ4.
Оказалось, что активные и неактивные геномные компартменты в коже мамонта напоминают таковые в коже азиатского слона сильнее, чем в любой другой слоновьей ткани. При этом наблюдались и существенные отличия, к примеру, связанные с генами, отвечающими за рост шерсти у мамонта. Архитектура инактивированной Х-хромосомы у мамонта оказалась тетрадной (такую же обнаружили у современного слона), но не двухкомпонентной, как у мыши или человека. Также в образцах сохранились петли ДНК размером всего около 50 нанометров — эти структуры обеспечивают пространственную близость активирующих последовательностей ДНК к активируемым ими генам, что дает представление не только об экспрессии генов, но и о механизмах ее запуска.
Дополнительное сопоставление с физическим устройством хроматина современного слона показало, что ДНК мамонта в образце крайне слабо подверглась диффузии в другие клеточные компартменты, что указывает на ее исключительно низкую фрагментацию. Исследователи предположили, что такая не наблюдавшаяся прежде сохранность кариотипа обусловлена одновременно замораживанием и высушиванием ткани с последующей витрификацией вскоре после смерти животного — процессом, схожим с сублимацией пищевых продуктов для их консервации. Чтобы проверить это, они проанализировали методом in situ Hi-C образцы свежей говядины, пролежавшей 96 часов при комнатной температуре и предварительно высушенной, хранившейся год. Оказалось, что в сушеном образце структура хроматина сохранна и устойчива к разнообразным сильным воздействиям, таким как погружение в кислоту, переезд автомобилем и выстрел из дробовика, что свидетельствует в пользу гипотезы.
Получив подобные результаты, авторы работы успешно (хотя и с меньшей детализацией) применили PaleoHi-C для реконструкции хроматина Юки — самки мамонта, чьи останки возрастом 39 тысяч лет считаются одними из наиболее сохранных в распоряжении науки. Таким образом, эта методика может найти дальнейшее применение для анализа хромосом в хорошо сохранившихся образцах древних тканей.
О том, как зарождалось и развивалось изучение древней ДНК, какое значение для классификации современных организмов оно имеет, как с его помощью обнаружили новые виды людей и уточнили филогенетическое положение известных и как оно стало поводом для присуждения Нобелевской премии, рассказано в материале «Человек, который собрал древних».
На 48-50 миллионов лет раньше, чем считалось прежде
Палеонтологи описали новый вид энанциорнисовых птиц, который обитал на территории современного Китая около 120 миллионов лет назад. Он получил название Imparavis attenboroughi — в честь знаменитого натуралиста и телеведущего Дэвида Аттенборо. Интересно, что представители данного вида обладали беззубыми клювами, хотя ранее считалось, что энанциорнисы начали терять зубы примерно на 50 миллионов лет позже, в позднем мелу. Описание древней птицы опубликовано в статье для журнала Cretaceous Research.