Универсальная нанопора поможет эффективно секвенировать белки

Она работает за счет электроосмотического потока

Нидерландские и итальянские исследователи разработали нанопору, которая обеспечивает одностороннее пропускание линейных полипептидных цепочек любого состава и сложности под действием электроосмотического потока. Ее можно использовать для создания портативных устройств секвенирования белков независимо от распределения в них электрических зарядов, а возможно, и других слабо или неравномерно заряженных полимеров. Публикация об этом появилась в журнале Nature Biotechnology.

Нанопоры широко используются в секвенировании цепочек ДНК — равномерно и достаточно сильно заряженные биомолекулы проходят через них в одном направлении под действием электрофоретической силы (ЭФС, EPF) при приложении источника тока, а в момент прохождения можно различить отдельные нуклеотиды. С белками все сложнее — их аминокислотные остатки могут иметь разные заряды или быть незаряженными, а значит, скорость и направление их перемещения в электрическом поле будут разными. Предпринимались попытки использовать для решения этой проблемы электроосмотический поток (ЭОП, EOF), в котором движущей силой выступает ток воды под действием суммарного заряда ионов в нанопоре. Для этого исследуемые белки прикрепляли к цепочке ДНК или снабжали их отрицательно заряженными полипептидными метками. Однако такие системы довольно сложны и подходят лишь для анализа относительно простых белков.

Сотрудники Гронингенского университета и Римского университета Тор Вергата под руководством Джованни Мальи (Giovanni Maglia) взяли за основу нанопору цитотоксина К (CytK) грам-положительной бактерии Bacillus cereus. Она состоит из сферического преддверия диаметром 4,5 нанометра и бета-цилиндра длиной пять и диаметром два нанометра. Последний обеспечивает электрическое сопротивление нанопоры. Благодаря двум парам разнозаряженных аминокислотных остатков — K(лизин)128—E(глутамат)139 и K155—E11 — он электрически нейтрален, неселективен в отношении ионов — p(K+)/p(Cl-) около 0,99 — и не производит значимого ЭОП.

Экспериментируя с заменой разных аминокислотных остатков CytK на отрицательно заряженный аспартат (D), исследователи обнаружили, что наибольшей селективностью ионов — p(K+)/p(Cl-) 4,04 — обладает вариант с четырьмя такими заменами K128D-Q145D-S151D-K155D-CytK (2E-4D-CytK). Мутантная форма с заменой отрицательных зарядов на положительно заряженный лизин E112K-E139K-Q145K-S151K-Cyt (6K-CytK) обладала селективностью к катионам 0,207 при pH 7,5 и практически не утрачивала ее (0,213) в кислой среде (pH 3,8), в которой обычный CytK (WT-CytK) проявлял селективность к анионам — p(K+)/p(Cl-) 0,606 — из-за протонирования кислых остатков E112 и E139.

Линейный развернутый модельный полипептид S1 (123 аминокислоты), содержащий длинные положительно заряженные фрагменты из остатков аргинина (обозначается R), проходил через WT-CytK под действием ЭФС только при превышении порогового тока в −150 милливольт. При меньшем токе он входил в пору, но блокировался в ней. Использование 2E-4D-CytK снижало порог до −30 милливольт, и с увеличением разности потенциалов скорость прохождения S1 через нанопору возрастала линейно за счет ЭОП, действующей однонаправленно с ЭФС. Схожий эффект с порогом около −100 милливольт наблюдался в экспериментах с модельными полипептидами tzatziki (в котором равномерно чередуются положительные и отрицательные заряды; всего 140 аминокислот), и mujdei (который представляет собой tzatziki с пятью отрицательно заряженными остатками посередине), хотя в этих случаях ЭФС и ЭОП действовали разнонаправленно. То есть ЭОП в 2E-4D-CytK значительно превышала ЭФС. При испытаниях 6K-CytK, в котором ЭОП генерируют анионы, подобного эффекта добиться не удалось — все модельные полипептиды входили в нанопору, но застревали в ней.

Моделирование методом молекулярной динамики подтвердило, что исследуемый пептид движется сквозь 2E-4D-CytK в одном заданном направлении, даже когда ЭФС направлена против ЭОП.

Для испытаний неэнзиматического перемещения более сложных белков, содержащих дестабилизирующие мутации, использовали мальтозосвязывающий белок malE219a (412 аминокислот, плотность заряда −2,3100 при pH 7,5); глюкозосвязывающий белок H152A-GBP (341 аминокислота, плотность заряда −1,8100 при pH 7,5) и дигидрофолатредуктазу W30G-W133L-DHFR (170 аминокислот, плотность заряда −6,1100 при pH 7,5). В качестве нейтрального денатурирующего агента применяли 2—2,4-молярные растворы мочевины. Все эти белки проходили через нанопору под действием ЭОП с пороговым током −60 (malE219a) и −80 (H152A-GBP и W30G-W133L-DHFR) милливольт. Проходя через пору, полипептиды продуцировали индивидуальные паттерны остаточных токов, что потенциально можно использовать для их идентификации. При использовании заряженного денатуранта 1—1,8-молярного гуанидинхлорида белки также проходили через нанопору против ЭФС, однако с меньшей эффективностью и более высокоми значениями порогового тока (вероятно, за это отвечало связывание ионов гуанидин-Н+ с остатками аспартата в нанопоре).

Таким образом, нанопоры с фиксированными последовательно отрицательными зарядами могут пропускать в одном направлении белки разного строения и с разными плотностями зарядов, в том числе в присутствии денатурантов для развертывания их вторичной и третичной структуры. На основе таких нанопор можно разрабатывать высокоэффективные и портативные приборы для идентификации и секвенирования белков, полагают исследователи.

В марте 2023 года сотрудники Массачусетского технологического института представили молекулярный шприц для адресной доставки различных белков, включая редакторы генома, внутрь клетки. Основой для него послужили молекулярные инъекционные системы эндосимбиотических бактерий.

Нашли опечатку? Выделите фрагмент и нажмите Ctrl+Enter.
«Тестостерон: гормон, который разделяет и властвует»

Как тестостерон влияет на агрессивность благородных оленей

Мнение редакции может не совпадать с мнением автора