Универсальная нанопора поможет эффективно секвенировать белки

Нидерландские и итальянские исследователи разработали нанопору, которая обеспечивает одностороннее пропускание линейных полипептидных цепочек любого состава и сложности под действием электроосмотического потока. Ее можно использовать для создания портативных устройств секвенирования белков независимо от распределения в них электрических зарядов, а возможно, и других слабо или неравномерно заряженных полимеров. Публикация об этом появилась в журнале Nature Biotechnology.

Нанопоры широко используются в секвенировании цепочек ДНК — равномерно и достаточно сильно заряженные биомолекулы проходят через них в одном направлении под действием электрофоретической силы (ЭФС, EPF) при приложении источника тока, а в момент прохождения можно различить отдельные нуклеотиды. С белками все сложнее — их аминокислотные остатки могут иметь разные заряды или быть незаряженными, а значит, скорость и направление их перемещения в электрическом поле будут разными. Предпринимались попытки использовать для решения этой проблемы электроосмотический поток (ЭОП, EOF), в котором движущей силой выступает ток воды под действием суммарного заряда ионов в нанопоре. Для этого исследуемые белки прикрепляли к цепочке ДНК или снабжали их отрицательно заряженными полипептидными метками. Однако такие системы довольно сложны и подходят лишь для анализа относительно простых белков.

Сотрудники Гронингенского университета и Римского университета Тор Вергата под руководством Джованни Мальи (Giovanni Maglia) взяли за основу нанопору цитотоксина К (CytK) грам-положительной бактерии Bacillus cereus. Она состоит из сферического преддверия диаметром 4,5 нанометра и бета-цилиндра длиной пять и диаметром два нанометра. Последний обеспечивает электрическое сопротивление нанопоры. Благодаря двум парам разнозаряженных аминокислотных остатков — K(лизин)128—E(глутамат)139 и K155—E11 — он электрически нейтрален, неселективен в отношении ионов — p(K⁺)/p(Cl^-) около 0,99 — и не производит значимого ЭОП.

Экспериментируя с заменой разных аминокислотных остатков CytK на отрицательно заряженный аспартат (D), исследователи обнаружили, что наибольшей селективностью ионов — p(K⁺)/p(Cl^-) 4,04 — обладает вариант с четырьмя такими заменами K128D-Q145D-S151D-K155D-CytK (2E-4D-CytK). Мутантная форма с заменой отрицательных зарядов на положительно заряженный лизин E112K-E139K-Q145K-S151K-Cyt (6K-CytK) обладала селективностью к катионам 0,207 при pH 7,5 и практически не утрачивала ее (0,213) в кислой среде (pH 3,8), в которой обычный CytK (WT-CytK) проявлял селективность к анионам — p(K⁺)/p(Cl^-) 0,606 — из-за протонирования кислых остатков E112 и E139.

Линейный развернутый модельный полипептид S1 (123 аминокислоты), содержащий длинные положительно заряженные фрагменты из остатков аргинина (обозначается R), проходил через WT-CytK под действием ЭФС только при превышении порогового тока в −150 милливольт. При меньшем токе он входил в пору, но блокировался в ней. Использование 2E-4D-CytK снижало порог до −30 милливольт, и с увеличением разности потенциалов скорость прохождения S1 через нанопору возрастала линейно за счет ЭОП, действующей однонаправленно с ЭФС. Схожий эффект с порогом около −100 милливольт наблюдался в экспериментах с модельными полипептидами tzatziki (в котором равномерно чередуются положительные и отрицательные заряды; всего 140 аминокислот), и mujdei (который представляет собой tzatziki с пятью отрицательно заряженными остатками посередине), хотя в этих случаях ЭФС и ЭОП действовали разнонаправленно. То есть ЭОП в 2E-4D-CytK значительно превышала ЭФС. При испытаниях 6K-CytK, в котором ЭОП генерируют анионы, подобного эффекта добиться не удалось — все модельные полипептиды входили в нанопору, но застревали в ней.

Моделирование методом молекулярной динамики подтвердило, что исследуемый пептид движется сквозь 2E-4D-CytK в одном заданном направлении, даже когда ЭФС направлена против ЭОП.

Для испытаний неэнзиматического перемещения более сложных белков, содержащих дестабилизирующие мутации, использовали мальтозосвязывающий белок malE219a (412 аминокислот, плотность заряда −2,3₁₀₀ при pH 7,5); глюкозосвязывающий белок H152A-GBP (341 аминокислота, плотность заряда −1,8₁₀₀ при pH 7,5) и дигидрофолатредуктазу W30G-W133L-DHFR (170 аминокислот, плотность заряда −6,1₁₀₀ при pH 7,5). В качестве нейтрального денатурирующего агента применяли 2—2,4-молярные растворы мочевины. Все эти белки проходили через нанопору под действием ЭОП с пороговым током −60 (malE219a) и −80 (H152A-GBP и W30G-W133L-DHFR) милливольт. Проходя через пору, полипептиды продуцировали индивидуальные паттерны остаточных токов, что потенциально можно использовать для их идентификации. При использовании заряженного денатуранта 1—1,8-молярного гуанидинхлорида белки также проходили через нанопору против ЭФС, однако с меньшей эффективностью и более высокоми значениями порогового тока (вероятно, за это отвечало связывание ионов гуанидин-Н⁺ с остатками аспартата в нанопоре).

Таким образом, нанопоры с фиксированными последовательно отрицательными зарядами могут пропускать в одном направлении белки разного строения и с разными плотностями зарядов, в том числе в присутствии денатурантов для развертывания их вторичной и третичной структуры. На основе таких нанопор можно разрабатывать высокоэффективные и портативные приборы для идентификации и секвенирования белков, полагают исследователи.

В марте 2023 года сотрудники Массачусетского технологического института представили молекулярный шприц для адресной доставки различных белков, включая редакторы генома, внутрь клетки. Основой для него послужили молекулярные инъекционные системы эндосимбиотических бактерий.