Универсальная нанопора поможет эффективно секвенировать белки
Она работает за счет электроосмотического потока
Нидерландские и итальянские исследователи разработали нанопору, которая обеспечивает одностороннее пропускание линейных полипептидных цепочек любого состава и сложности под действием электроосмотического потока. Ее можно использовать для создания портативных устройств секвенирования белков независимо от распределения в них электрических зарядов, а возможно, и других слабо или неравномерно заряженных полимеров. Публикация об этом появилась в журнале Nature Biotechnology.
Нанопоры широко используются в секвенировании цепочек ДНК — равномерно и достаточно сильно заряженные биомолекулы проходят через них в одном направлении под действием электрофоретической силы (ЭФС, EPF) при приложении источника тока, а в момент прохождения можно различить отдельные нуклеотиды. С белками все сложнее — их аминокислотные остатки могут иметь разные заряды или быть незаряженными, а значит, скорость и направление их перемещения в электрическом поле будут разными. Предпринимались попытки использовать для решения этой проблемы электроосмотический поток (ЭОП, EOF), в котором движущей силой выступает ток воды под действием суммарного заряда ионов в нанопоре. Для этого исследуемые белки прикрепляли к цепочке ДНК или снабжали их отрицательно заряженными полипептидными метками. Однако такие системы довольно сложны и подходят лишь для анализа относительно простых белков.
Сотрудники Гронингенского университета и Римского университета Тор Вергата под руководством Джованни Мальи (Giovanni Maglia) взяли за основу нанопору цитотоксина К (CytK) грам-положительной бактерии Bacillus cereus. Она состоит из сферического преддверия диаметром 4,5 нанометра и бета-цилиндра длиной пять и диаметром два нанометра. Последний обеспечивает электрическое сопротивление нанопоры. Благодаря двум парам разнозаряженных аминокислотных остатков — K(лизин)128—E(глутамат)139 и K155—E11 — он электрически нейтрален, неселективен в отношении ионов — p(K+)/p(Cl-) около 0,99 — и не производит значимого ЭОП.
Экспериментируя с заменой разных аминокислотных остатков CytK на отрицательно заряженный аспартат (D), исследователи обнаружили, что наибольшей селективностью ионов — p(K+)/p(Cl-) 4,04 — обладает вариант с четырьмя такими заменами K128D-Q145D-S151D-K155D-CytK (2E-4D-CytK). Мутантная форма с заменой отрицательных зарядов на положительно заряженный лизин E112K-E139K-Q145K-S151K-Cyt (6K-CytK) обладала селективностью к катионам 0,207 при pH 7,5 и практически не утрачивала ее (0,213) в кислой среде (pH 3,8), в которой обычный CytK (WT-CytK) проявлял селективность к анионам — p(K+)/p(Cl-) 0,606 — из-за протонирования кислых остатков E112 и E139.
Линейный развернутый модельный полипептид S1 (123 аминокислоты), содержащий длинные положительно заряженные фрагменты из остатков аргинина (обозначается R), проходил через WT-CytK под действием ЭФС только при превышении порогового тока в −150 милливольт. При меньшем токе он входил в пору, но блокировался в ней. Использование 2E-4D-CytK снижало порог до −30 милливольт, и с увеличением разности потенциалов скорость прохождения S1 через нанопору возрастала линейно за счет ЭОП, действующей однонаправленно с ЭФС. Схожий эффект с порогом около −100 милливольт наблюдался в экспериментах с модельными полипептидами tzatziki (в котором равномерно чередуются положительные и отрицательные заряды; всего 140 аминокислот), и mujdei (который представляет собой tzatziki с пятью отрицательно заряженными остатками посередине), хотя в этих случаях ЭФС и ЭОП действовали разнонаправленно. То есть ЭОП в 2E-4D-CytK значительно превышала ЭФС. При испытаниях 6K-CytK, в котором ЭОП генерируют анионы, подобного эффекта добиться не удалось — все модельные полипептиды входили в нанопору, но застревали в ней.
Моделирование методом молекулярной динамики подтвердило, что исследуемый пептид движется сквозь 2E-4D-CytK в одном заданном направлении, даже когда ЭФС направлена против ЭОП.
Для испытаний неэнзиматического перемещения более сложных белков, содержащих дестабилизирующие мутации, использовали мальтозосвязывающий белок malE219a (412 аминокислот, плотность заряда −2,3100 при pH 7,5); глюкозосвязывающий белок H152A-GBP (341 аминокислота, плотность заряда −1,8100 при pH 7,5) и дигидрофолатредуктазу W30G-W133L-DHFR (170 аминокислот, плотность заряда −6,1100 при pH 7,5). В качестве нейтрального денатурирующего агента применяли 2—2,4-молярные растворы мочевины. Все эти белки проходили через нанопору под действием ЭОП с пороговым током −60 (malE219a) и −80 (H152A-GBP и W30G-W133L-DHFR) милливольт. Проходя через пору, полипептиды продуцировали индивидуальные паттерны остаточных токов, что потенциально можно использовать для их идентификации. При использовании заряженного денатуранта 1—1,8-молярного гуанидинхлорида белки также проходили через нанопору против ЭФС, однако с меньшей эффективностью и более высокоми значениями порогового тока (вероятно, за это отвечало связывание ионов гуанидин-Н+ с остатками аспартата в нанопоре).
Таким образом, нанопоры с фиксированными последовательно отрицательными зарядами могут пропускать в одном направлении белки разного строения и с разными плотностями зарядов, в том числе в присутствии денатурантов для развертывания их вторичной и третичной структуры. На основе таких нанопор можно разрабатывать высокоэффективные и портативные приборы для идентификации и секвенирования белков, полагают исследователи.
В марте 2023 года сотрудники Массачусетского технологического института представили молекулярный шприц для адресной доставки различных белков, включая редакторы генома, внутрь клетки. Основой для него послужили молекулярные инъекционные системы эндосимбиотических бактерий.
Слушатели мужского пола тоже ее заметили, но предпочтения не выразили
Иследователи из Австралии, Германии и Италии обнаружили, что и мужчины, и женщины распознают высокую певческую форманту в голосах солистов хора, а женщины еще и предпочитают ее. Уже было известно, что певческая форманта в голосах старших солистов хора становится выше, когда в зале присутствуют девушки. Тот факт, что слушатели обоих полов чувствительны к этому, может говорить о том, что совместное пение — или занятие музыкой вообще — может поддерживать одновременно и сотрудничество, и конкуренцию. Результаты опубликованы в Biology Letters. Одни эволюционные теории предполагают, что музыка помогает нам устанавливать и поддерживать социальные связи. Другие, наоборот, говорят о том, что музыка может поддерживать конкуренцию. Но не исключено, что музыка выполняет обе эти функции одновременно. Несколько лет назад ученые из Лейпцига исследовали Томанерхор (хор Святого Фомы), в котором поют мальчики разного возраста. Они обнаружили, что, когда в аудитории присутствовали девочки и женщины, самые старшие мальчики (басы) во время исполнения хорала и фуги повышали свою певческую форманту до 2500–3500 герц (это придает голосу певца приятную звонкость). Вероятно, мальчики таким образом пытались конкурировать за женское внимание, при этом совместное музыкальное исполнение не пострадало. Теперь Питер Келлер (Peter E. Keller) из Университета Западного Сиднея и его коллеги из разных стран решили выяснить, слышат ли люди увеличенную певческую форманту, и если да — действительно ли девочки и женщины ее предпочитают. Они провели два онлайн-опроса, участникам которых предлагалось прослушать несколько пар коротких отрывков из двух живых выступлений Томанерхора: одни отрывки были взяты из выступлений, когда в аудитории были девушки, а другие — из выступлений, когда девушек в зале не было. Один опрос проверял, смогут ли люди понять, какие отрывки исполнялись при девушках; в нем участвовало 679 девушек и женщин в возрасте от 12 до 71 года и 481 мальчиков и мужчин от 12 до 86 лет. Участники второго опроса (состав по полу и возрасту был аналогичным — 655 девочек и женщин и 432 мальчиков и мужчин) просто должны были выбрать отрывок, который им больше понравился. Участники первого опроса независимо от пола чаще, чем в половине случаев правильно определяли, какие отрывки исполнялись при девушках. То есть и мужчины, и женщины (и мальчики с девочками) были чувствительны к высокой певческой форманте. Однако это было справедливо лишь для гомофонического хорала, когда все солисты поют одновременно. В случае полифонической фуги, когда участники хора поют поочередно, результаты были менее надежными. Возможно, это из-за того, что старшие солисты хора чаще увеличивают форманту, исполняя хорал, а не фугу. Второй опрос показал, что слушательницы предпочитают высокую певческую форманту: девочкам и женщинам чаще нравились те отрывки, которые исполнялись в присутствии девушек. В случае хорала предпочтение было более явным. А вот слушателям мужского пола было все равно: они одинаково часто выбирали отрывки из обоих выступлений. Получается, что слушатели обоих полов одинаково чувствительны к увеличенной форманте хористов, которая возникает, когда в зале есть девушки, но только девочки и женщины достоверно предпочитают ее. Это подтверждает гипотезу о том, что старшие солисты хора в присутствии девушек начинают петь иначе, следуя за своими конкурентными стремлениями — чтобы привлечь слушательниц. Тем не менее, такая конкуренция на индивидуальном уровне сосуществует с социальным сотрудничеством на уровне группы. В таком случае человеческий хор представляет собой гибкую форму социального поведения, которая обеспечивает одновременную групповую сплоченность и сексуально мотивированную конкуренцию. Нечто подобное можно наблюдать в поведении самцов других животных: некоторые насекомые, лягушки и афалины поют хором, чтобы привлечь самок. Во время совместных выступлений самцы одновременно и сотрудничают (поскольку самок привлекает хор), и конкурируют друг с другом. Вот, например, самцы сверчков: они поют хором, однако каждый отдельный сверчок готов запеть вместе с другими лишь тогда, когда находится от них на достаточном расстоянии. Когда конкуренты слишком близко, высок риск проиграть, а значит, лучше поберечь силы. Кроме того, во время совместного пения отдельные самцы могут производить более интенсивные сигналы или начинать петь раньше других, маскируя тем самым сигналы соперников.
