Молекулярный шприц ввел редакторы генома точно в заданные клетки

Американские исследователи выяснили, что молекулярные инъекционные системы, обнаруженные у некоторых эндосимбиотических бактерий, можно перепрограммировать для целевой доставки в человеческие клетки разнообразных белков, включая генетические ножницы Cas9, редакторы азотистых оснований и токсины. Отчет о работе опубликован в журнале Nature.

Эндосимбиотическим бактериям зачастую выгодно модулировать жизнедеятельность организма-хозяина для поддержания его приспособляемости, как правило с помощью секретируемых белковых молекул. Однако многие из таких веществ не проникают сквозь клеточную мембрану, и многие бактерии в процессе эволюции выработали сложные молекулярные устройства для их активной доставки.

Примером может служить семейство контрактильных инъекционных систем (CIS), которые действуют по принципу шприца и напоминают по устройству хвост бактериофагов. CIS представляют собой макромолекулярные комплексы, включающие жесткую трубчатую структуру (действует как игла), расположенную внутри сократимой оболочки (резервуар и поршень), которая закреплена на базальной пластинке с хвостовыми фибриллами и заостренными шиповидными белками (крепление к клетке-мишени). Для взаимодействия с эукариотическими клетками без непосредственного контакта бактерии синтезируют и выбрасывают наружу экстрацеллюлярные CIS (eCIS).

Учитывая функционал eCIS, сотрудники лаборатории Фэна Чжана (Feng Zhang) в Массачусетском технологическом институте решили изучить возможность их использования для адресной доставки белков в исследовательских и терапевтических целях. Для работы они выбрали типичную eCIS — кассету вирулентности PVC энтомопатогенной бактерии Photorhabdus asymbiotica, которая живет в круглых червях, паразитирующих на насекомых.

Ранее исследователи охарактеризовали молекулярную структуру PVC и процесс ее сборки, сумели с ее помощью сделать инъекцию в мышиный макрофаг и в общих чертах разобрались, как она заполняется действующим веществом (его гены расположены сразу после генов PVC, а взаимодействие происходит с помощью отсекаемой N-концевой сигнальной пептидной последовательности искомого белка и встроенной в PVC АТФазы Pvc15).

Новую работу авторы начали с того, что с помощью двух плазмид ввели гены PVC и ее естественной полезной нагрузки в кишечную палочку (Escherichia coli) для их биоинженерного производства, и убедились, что конечный продукт надежно связывается в культуре с клетками-мишенями насекомых Sf9. После этого к генам PVC присоединили гены несвойственной для нее нагрузки, в частности, зеленого флуоресцентного белка (GFP), Cre-рекомбиназы и искусственной рестриктазы с цинковыми пальцами, а также открытой ранее N-концевой сигнальной последовательности. В присутствии Pvc15 эти белки успешно загружались в биоинженерную PVC, и их комплекс сохранялся в процессе очистки. При его инкубации с Sf9 в этих клетках наблюдался четкий флуоресцентный сигнал, то есть инъекция искомого белка прошла успешно.

Механизм распознавания клетки-мишени PVC был мало изучен, и исследователи предположили, что он, как у бактериофагов, связан с рецептор-связывающими доменами на хвостовых фибриллах Pvc13. С помощью моделирования in silico они определили трехмерную структуру дистального конца фибриллы, который, предположительно, первым входит в контакт с клеточной мембраной. В него вставили домены Ad5-knob или E01-DARPin, специфичные к человеческим клеткам, и убедились, что такие PVC связываются с клетками человеческой аденокарциномы легкого A549 и вводят в них свое содержимое. Используя разные рецептор-связывающие домены, авторы работы продемонстрировали, что PVC можно перепрограммировать под разнообразные мышиные и человеческие клетки-мишени с эффективностью и специфичностью, близкими к 100 процентам.

Следующая серия экспериментов продемонстрировала, что PVC пригодна для доставки в клетки различных по структуре и функциям белков, в том числе в разы превышающие по молекулярной массе ее естественную полезную нагрузку (токсины Pdp1 и Pnf). Это выяснили, в частности, на примере инструментов для редактирования генома — эндонуклеазы Cas9 и деаминаз с цинковыми пальцами ZFD-L и ZFD-R.

В завершение исследователи провели опыт in vivo — успешно ввели Cre-рекомбиназу в нейроны гиппокампа нокаутных мышей, заставив эти клетки экспрессировать флуоресцентный белок tdTomato. Никаких значимых признаков токсичности и иммуногенности при этом не наблюдалось.

Как пишут авторы работы, полученные результаты свидетельствуют, что инъекционные системы PVC представляют собой программируемые устройства для доставки белков с возможностями применения в генной терапии, лечении рака и биоконтроле.

В 2020 году немецкие исследователи представили методику таргетной доставки лекарств внутрь раковых клеток с помощью наночастиц из муцина, сшитого фрагментами ДНК. Такая конструкция высвобождает препарат только в присутствии микроРНК, сверхэкспрессия которой характерна для некоторых злокачественных новообразований.