Диагностический краситель оказался противоядием от бледной поганки

Китайские и австралийские исследователи обнаружили, что краситель индоцианин зеленый, который используется как диагностическое средство, может служить антидотом основного токсина поганок и некоторых других ядовитых грибов. Публикация об этом появилась в журнале Nature Communications.

Бледная поганка (Amanita phalloides) — широко распространенный и самый ядовитый гриб, с которым связано около 90 процентов смертей от отравления грибами. Прогноз при ее употреблении неблагоприятный и связан с необратимой печеночной или почечной недостаточностью. Она содержит несколько токсинов, самый сильный из них — альфа-аманитин из семейства аматоксинов, который содержат и некоторые другие представители рода Amanita, а также Galerina, Pholiotina и Lepiota. Считается, что его действие у человека обусловлено ингибированием ключевого фермента синтеза белка РНК-полимеразы II с последующим выбросом фактора некроза опухолей альфа, окислительным стрессом и апоптозом клеток. Специфического антидота альфа-аманитина пока не существует, хотя было показано, что некоторые имеющиеся препараты (к примеру, силибинин, ацетилцистеин и пенициллин) могут снижать его токсичность по неустановленному механизму.

В поисках антидота сотрудники Университета Сунь Ятсена, Института медицинских исследований Гарвана и Сиднейского университета под руководством Цяопина Вана (Qiao-Ping Wang) воспользовались разработанной ранее и опробованной на токсине морской осы (Chironex fleckeri) концептуальной схемой систематического поиска противоядий. Она включает идентификацию молекулярных мишеней с помощью полногеномного нокаутного CRISPR-скрининга и подбор лигандов для них путем виртуального скрининга лекарств, одобренных FDA.

Основанный на модели анализ CRISPR-скрининга (MAGeCK) помог выявить несколько биологических процессов, связанных с гибелью клетки под действием альфа-аманитина. Помимо ожидаемой трансляции под действием РНК-полимеразы II они включали апоптоз, биосинтез N-гликанов и метаболизм холестерина. Особый интерес вызвал биосинтез N-гликанов, поскольку два из десяти наиболее затронутых токсином генов — STT3B и MGAT1 — были его компонентами. Блокирование этого процесса различными способами показало, что он обязателен для цитотоксического действия альфа-аманитина и, в частности, STT3B (часть комплекса фермента олигосахарилтрансферазы) регулирует проникновение этой молекулы в клетку.

Выяснив это, исследователи провели скрининг in silico по 3201 молекуле из библиотек FDA (ZINC и Drugbank) и отобрали 34 потенциальных кандидата в блокаторы STT3B. 10 из них оказались недоступны, остальные 24 испытали на клеточных культурах. Два из них — противогрибковый препарат позаконазол и флуоресцентный краситель индоцианин зеленый — предотвращали гибель большинства человеческих клеток линии HAP1 при действии альфа-аманитина, не проявляя при этом собственной цитотоксичности.

Авторы работы остановили выбор на индоцианине зеленом по двум причинам. Во-первых, при компьютерном молекулярном моделировании он надежно блокировал каталитический центр STT3B, связываясь с тремя его аминокислотами (Ser319, Trp380 и Ser449) водородными связями, а с одной из них (Trp380) дополнительно π-стэкингом. Во-вторых, этот препарат одобрен FDA в 1956 году и сейчас широко используется в ангиографии, диагностике нарушений кровообращения и оценке печеночной функции; не метаболизируется, быстро выводится гепатоцитами и при однократном введении в стандартной дозе (0,5 миллиграмма на килограмм массы тела) не обладает значимыми побочными эффектами.

В дальнейшей серии экспериментов исследователи убедились, что индоцианин зеленый значимо повышает выживаемость клеток в культурах линий HAP1 и HepG2, а также мышиных печеночных органоидах при действии альфа-аманитина. Тестирование с помощью биолюминесцентной репортерной системы показало, что этот эффект реализуется именно за счет ингибирования STT3B.

В ходе испытаний in vivo мышам ввели внутрибрюшинно 0,33 миллиграмма альфа-аманитина на килограмм массы тела. Через четыре, шесть и восемь часов им сделали три внутривенные инъекции по пять миллиграмм на килограмм массы тела (примерный эквивалент эффективной дозы у человека) индоцианина зеленого. Препарат быстро распределялся в организме, в течение двух часов накапливаясь преимущественно в печени.

Биохимический анализ крови показал, что индоцианин зеленый эффективно снижал повышенные альфа-аманитином уровни маркеров повреждения печени (щелочная фосфатаза, аспартат- и аланинтрансаминаза) и почек (азот мочевины крови и креатинин). Гистологическое исследование подтвердило, что препарат способен предотвращать вызываемый токсином некроз этих органов. В целом индоцианин зеленый к 30-му дню повышал вероятность выживания отравленных животных с 12,5 (без лечения) до 50 процентов. Эффективность сильно зависела от времени введения: значительно повышалась при сокращении интервалов до часа и снижалась — при увеличении до 8 и 12 часов, то есть препарат желательно вводить сразу при подозрении на отравление поганками.

Для разрешения на применение индоцианина зеленого по этим показаниям у людей необходимы дальнейшие доклинические и клинические испытания. Авторы подчеркивают, что полученные результаты свидетельствуют об эффективности комбинации полногеномного CRISPR-скрининга с виртуальным скринингом существующих лекарств для быстрого поиска широкого спектра противоядий.

Ранее в 2023 году японские исследователи продемонстрировали на мышах и крысах, что антидот из двух синтетических гемов может защитить от угарного газа и цианидов, которые часто становятся причиной смерти при пожарах. В 2018 году китайско-американская научная группа смогла нейтрализовать у мышей укус китайской рыжей сколопендры противосудорожным препаратом ретигабином.