Цитофлуориметрия твердых тканей сократила время поиска опухолевых клеток во время операции

Немецкие ученые разработали подход для быстрого обнаружения опухолевых клеток в твердых тканях. Их механически измельчают, помещают в буферный раствор и исследуют форму, размер и степень деформации клеток в цитофлуориметре. По этим параметрам можно отличить здоровые клетки от опухолевых. Как сообщается в журнале Nature Biomedical Engineering, такая диагностика оказалась достаточно точной, при этом на нее ушло не более 30 минут. Новый подход можно успешно использовать в интраоперационной диагностике опухолей. 

Изменение морфологии клеток — размера и/или формы — используют как диагностический признак многих заболеваний: например, малярии, диабета или онкологических болезней. Однако изучение морфологии клеток сопряжено с техническими трудностями и до сих пор не стало рутинным методом исследования. Наиболее перспективным из них, который преодолел недостатки предыдущих версий, стал метод флуоресцентной цитометрии с исследованием деформируемости клеток в реальном времени (RT-FDC). Микрофлюидный подход в этом анализе позволяет оценивать форму каждой клетки по ее изображению с высокой пропускной способностью без дополнительного мечения их моноклональными антителами. Метод уже зарекомендовал себя в диагностике лейкозов и инфекционных заболеваний. 

Однако пока никто не изучал его потенциал для исследования биоптатов твердых тканей солидных опухолей. Обычно такой диагностикой занимаются патологоанатомы прямо во время операции: они фиксируют препарат, разрезают его, окрашивают и рассматривают. Все это требует много времени и ресурсов, а также большого опыта патологоанатома для достоверной экспертизы. Поэтому Йохен Гук (Jochen Guck) из Института физики Общества Макса Планка исследовал, может ли RT–FDC преодолеть эти недостатки классического метода исследования биоптатов солидных опухолей.

Чтобы разъединить тканевую массу на мелкие гетерогенные клеточные популяции, ученые использовали тканевой измельчитель по типу гриндера. Устройство автоматически выполняет заданную последовательность чередующихся операций резки и измельчения для выделения отдельных клеток из твердой ткани. По сравнению с рутинной ферментной дисагрегацией тканей жизнеспособность клеток после измельчения оказалась схожей: около 70-90 процентов от нативного материала. Однако ключевым преимуществом механической диссоциации было то, что время обработки каждого образца составляло менее пяти минут, в отличие от десятков минут или даже нескольких часов для ферментативных протоколов. 

Выделенные с помощью механического разделения единичные клетки изучали с помощью RT–FDC. Сотни клеток в секунду, взвешенных в вязком метилцеллюлозном буфере, пропускали через сужение микрофлюидного канала, где они деформировались под действием напряжения сдвига и градиентов давления, и эту деформацию фиксировали с помощью микрофотографии. На основе изображений в режиме реального времени рассчитывалась степень деформации клетки, ее прозрачности, изменения размеров и соотношения длины сторон и площади. Кроме того, с помощью флуоресценции определяли экспрессию маркеров клеточной поверхности.

Исследование RT–FDC клеток печени, толстой кишки и почек показало разницу морфологии клеток и экспрессии поверхностных маркеров. С помощью обычной проточной цитометрии ученым не удалось отделить разные клеточные популяции без дополнительной панели флуоресцентных антител. Используя соотношение сторон и площади клеток в RT–FDC, ученым даже удалось идентифицировать межклеточные контакты между клетками тимуса, селезенки и почек с помощью микрофотографий и определения поверхностных маркеров. 

После этого ученые изучили, как меняется фенотип клеток толстой кишки в модели неспецифического воспаления. Оказалось, что лейкоциты из зоны поражения более устойчивы к деформации, чем клетки из здоровых тканей (р = 0,0065). После ученые решили проверить, насколько новый метод подходит для обнаружения морфологически измененных опухолевых клеток в мышиной модели колоректального рака. 

Они обследовали в общей сложности 16 мышей и сравнили клетки, выделенные из опухолей, с клетками из здоровой части толстой кишки того же животного. В биоптате опухоли ученые обнаружили увеличение размера эпителиальных клеток и более высокую степень деформации по сравнению со здоровым участком органа.

Затем исследователи проверили, можно ли использовать морфологические различия клеток, которые находят с помощью RT–FDC, для верификации опухолевой или здоровой ткани. Для этого клетки разделили на три категории в зависимости от размера клеток (60-90, 80-120 и 120-400 квадратных микрометров). В каждой категории изучали несколько характеристик: среднее значение, медиана и стандартные отклонения размера клетки, степень деформации и соотношение сторон и площади. С помощью метода главных компонент ученые определили, что деформация и размер клеток были независимыми предикторами опухолей в образцах толстой кишки мыши. Следовательно их можно использовать в качестве диагностического маркера, измеряемые с помощью RT–FDC. 

Чтобы удостовериться в универсальности метода, ученые проверили, как он работает в случаях солидных опухолей у людей. Исследование 13 замороженных образцов биопсии колоректального рака и 13 образцов здоровых тканей от тех же людей заняло менее 30 минут (вместе с измельчением) и показало значимые различия в морфологии клеток из больных и здоровых образцов. Аналогичные результаты показало исследование нативных интраоперационных биоптатов от 14 пациентов с колоректальным раком и девяти пациентов с онкологическими заболеваниями легких. Причем метод был особенно полезным в ситуациях, когда опухолевых клеток мало, а хирургам нужно определить объем удаляемых тканей.

Таким образом, такой подход может стать удобной альтернативой классическому методу интраоперационной гистологической диагностики объема опухолевого поражения. Одним из наиболее важных достижений этой работы стоит считать применение метода цитофлуориметрии к механически измельченным твердым тканям без дополнительного мечения клеток, что значительно ускоряет процесс диагностики. 

Недавно мы рассказывали про другой, нетривиальный метод диагностики онкологических заболеваний. Французские ученые обнаружили, что муравьи могут отличать мышей с привитой человеческой злокачественной опухолью по запаху мочи.