Анализ транскриптома амниоцитов помог в клинической диагностике врожденных болезней

Гонконгские исследователи с участием немецких специалистов экспериментально показали, что полное секвенирование РНК клеток амниотической жидкости пригодно для пре- и постнатальной клинической диагностики наследственных заболеваний. Отчет о работе опубликован в журнале npj Genomic Medicine.

Амниотическую жидкость (околоплодные воды) забирают путем амниоцентеза, если при ультразвуковом исследовании выявляют какие-либо аномалии развития. Ее клетки, на 16–24 неделях беременности преимущественно происходящие из некератинизированной кожи плода, подвергают цитогенетическим и молекулярным исследованиям. Для диагностики заболеваний с менделевским наследованием используют полногеномный и полноэкзомный анализы с эффективностью 25–55 процентов. Полное секвенирование РНК повышает ее в среднем на 21 процент, при этом имеющиеся данные о транскриптоме клеток амниотической жидкости (амниоцитов) весьма скудны. В каталоге консорциума GTEx, содержащем более 50 референсных уровней экспрессии генов в разных тканях, информация о них отсутствует. Более того, в предыдущих исследованиях секвенировали бесклеточную РНК, которая обладает малым периодом полужизни, подвержена загрязнению посторонним генетическим материалом от лизиса фагоцитов и высоко вариабельна в отношении транскриптов с низкой концентрацией. Теоретически транскриптом амниоцитов в этом отношении более удобен, к тому же его можно получить отложенно из замороженных образцов околоплодных вод для постнатальной диагностики. На практике убедительной проверке это до сих пор не подвергали.

Чтобы восполнить этот пробел, Анита Кхань (Anita Kan) и Брайан Чхун (Brian Chung) из Гонконгского университета воспользовались 52 образцами амниотической жидкости, полученными на сроках беременности от 16 недель до 21 недели и трех дней. 29 из них принадлежали плодам мужского пола, 23 — женского. Четыре были носителями наследственных заболеваний, остальные вошли в контрольную группу.

Из всех образцов выделили амниоциты для полнотранскриптомного анализа. Глубина секвенирования составила 106–177 миллионов прочтений (медианная 122 миллиона), для 94 процентов оснований показатель качества достиг Q30. Более 12,5 тысячи генов прошли контроль качества. 2020 из них, связанные с врожденными дефектами и аномалиями развития, отобрали для дальнейшего анализа.

Профили экспрессии генов амниоцитов сопоставили с референсными значениями из каталога GTEx для фибробластов и цельной крови, поскольку эти биоматериалы наиболее часто используют для диагностики врожденных заболеваний по анализу РНК. Метод главных компонент (PCA) выявил в этих профилях три четких кластера, причем у амниоцитов и фибробластов они оказались схожими.

Из 2020 отобранных генов более половины выраженно — 10 и более транскриптов на миллион (TPM) — экспрессировались в амниоцитах и фибробластах (51 и 58 процентов соответственно, при этом они совпадали на 81 процент). Для цельной крови этот показатель составил лишь 22 процента. Дальнейший анализ показал, что амниоциты и фибробласты схожи друг с другом и выгодно отличаются от цельной крови по экспрессии диагностических генов, выявленных в исследованиях PAGE (Prenatal Assessment of Genomes and Exomes, пренатальная оценка геномов и экзомов) и DDD (Deciphering Developmental Disorders, расшифровка нарушений развития). При этом экспрессия большего числа таких генов в амниоцитах и фибробластах, чем в крови, наблюдалась по всем одиннадцати исследованным классам генных заболеваний.

Выяснив это, исследователи скооперировались с Висенте Епесом (Vicente Yépez) и Жюльеном Ганьёром (Julien Gagneur) из Мюнхенского технического университета, ранее разработавшими модульную автоматизированную систему секвенирования РНК DROP (Detection of RNA Outliers Pipeline, конвейер определения выбросов РНК; выброс здесь — результат измерения, резко выделяющийся из общей выборки). Эта система предназначена для выявления генов с аберрантной экспрессией, аберрантным сплайсингом и моноаллельной экспрессией, а также определения вариантов.

С помощью DROP исследователи проанализировали транскриптом четырех образцов амниоцитов, полученных от плодов (в том числе двух из разных беременностей одной женщины) с установленными наследственными заболеваниями. Анализ выявил эти заболевания во всех случаях. Попутно он подтвердил патогенность аберрантного сплайсинга генов CHD7 при синдроме CHARGE и COL1A2 при несовершенном остеогенезе II типа и уточнил функциональные последствия аберрантного сплайсинга гена MYRF при сердечно-урогенитальном синдроме (оказалось, что он приводит не только к поломке рамки считывания с последующей нонсенс-опосредованной деградацией мРНК, как предсказано in silico, но и к внутрирамочному сохранению 69 пар оснований интрона 14 с продукцией длинных транскриптов).

По информации авторов, эта работа стала первым подтверждением концепции того, что секвенирование РНК амниоцитов может служить полноценным клиническим инструментом для пренатальной диагностики врожденных заболеваний. При наличии криопресервированных образцов амниотической жидкости, забранных на 16–24 неделях беременности, ее клетки могут составить весомую альтернативу фибробластам и цельной крови при постнатальной диагностике методом полнотранскриптомного анализа, пишут исследователи.

В 2022 году швейцарским ученым удалось прочитать транскриптом отдельных клеток, не убивая их. Для этого они изымали половину цитоплазмы и секвенировали полученный генетический материал. Через шесть часов после такой биопсии клетки восстанавливали свой объем и продолжали делиться.