Им удалось внедрить тилакоиды хлоропластов в хондроциты мышей
Китайские биологи внедрили тилакоиды хлоропластов в клетки хрящевой ткани мышей, больных остеоартритом — и тем самым обеспечили протекание естественных растительных реакций фотосинтеза в этих клетках. Для этого они выделили тилакоиды из хлоропластов шпината и модифицировали их так, чтобы избежать отторжения иммунной системой организма-реципиента. Это позволило ученым восстановить в больных клетках уровень молекул АТФ и НАДФН — главных внутриклеточных источников энергии — необходимых для синтеза множества биохимических соединений. Восстановив таким образом нормальное функционирование хрящевых клеток мышей, ученые облегчили протекание у них остеоартрита. Работа опубликована в журнале Nature.
Биохимические реакции анаболизма — синтеза сложных молекулярных соединений — составляют неотъемлемую часть обмена веществ, происходящего в живых клетках. Нарушение протекания таких реакций приводит к сбою нормального функционирования клетки — и в дальнейшем может стать причиной развития различных заболеваний.
Для протекания анаболических реакций необходимо множество биохимических соединений. Два важнейших компонента — это молекулы АТФ (аденозинтрифосфата) — молекулярные переносчики энергии, и молекулы НАДФН (никотинамидадениндинуклеотидфосфата) — доноры электронов для окислительно-восстановительных реакций. При многих заболеваниях молекулы АТФ и НАДФН не синтезируются в достаточных количествах, что приводит к нарушению обмена веществ в клетке и, как следствие, развитию различных патологий.
К таким патологиям относится остеоартрит — заболевание, при котором в клетках хрящевой ткани (хондроцитах) из-за нехватки энергии нарушается синтез внеклеточных белков матрикса. Это приводит к постепенному разрушению суставной хрящевой ткани, что приводит к болям в суставах, а впоследствии может привести к их полной неподвижности.
Таким образом, перед учеными и врачами уже долгое время стоит задача — как обеспечить больные клетки достаточным количеством молекул АТФ и НАДФН. Существующие подходы основаны либо на том, чтобы доставлять АТФ и НАДФН в клетки извне (что в случае АТФ малоэффективно, а в случае НАДФН — опасно), либо на том, чтобы точечно модифицировать метаболические пути биосинтеза этих молекул в клетках (что очень трудно, потому что метаболические пути образуют огромную сеть, и сложно модифицировать один из путей так, чтобы не затронуть другие).
Разобраться с этой проблемой взялась группа исследователей из Китая под руководством Чена Пэнфэя (Chen Pengfei) из университета Чжэцзян. Для этого они предложили принципиально новый подход — для того, чтобы обеспечить больные клетки постоянным источником АТФ и НАДФН они решили внедрить в больные клетки тилакоиды хлоропластов, которые в ходе фотосинтеза синтезируют эти молекулы.
У растений молекулы АТФ и НАДФН образуются в процессе фотосинтеза, в ходе которого солнечная энергия используется для синтеза различных биомолекул. В природных условиях фотосинтез протекает в специализированных органеллах растительных клеток — хлоропластах, внутри которых находятся тилакоиды — мембранные пузырьки, содержащие все необходимые белки и компоненты для реакций фотосинтеза.
Именно тилакоиды — фактически готовые природные системы синтеза АТФ и НАДФН — решили использовать ученые для решения проблемы нехватки этих молекул в больных клетках. Для этого они разработали на основе тилакоидов нанотилакоидные структуры — везикулы, содержащие внутри тилакоиды хлоропластов, которые они затем внедрили в клетки мышей, больных остеоартритом.
Первым делом ученые собрали нанотилакоидные структуры из тилакоидов хлоропластов, которые они выделили из листьев шпината. Основная сложность при подготовке любых структур для пересадки из одного организма в другой (особенно когда речь идет о пересадке растительных структур в животные клетки) заключается в том, чтобы избежать отторжения иммунной системой организма-реципиента. Для того чтобы замаскировать тилакоиды от иммунной системы мышей, ученые поместили тилакоиды в везикулы (микроскопические пузырьки диаметром 100-150 нанометров), образованные из мембран мышиных хондроцитов. Это решило сразу две проблемы: во-первых, это обеспечило защиту тилакоидов от иммунной системы (которая не могла детектировать тилакоиды внутри везикул), а во-вторых, обеспечило их доставку внутрь хондроцитов — путем везикулярного эндоцитоза («проглатывания» клеткой содержимого везикул).
После инкубации нанотилакоидных структур с хондроцитами мышей, ученые оценили эффективность эндоцитоза и сохранности нанотилакоидных структур. Первым делом исследователи измерили концентрацию нанотилакоидных структур в хондроцитах. Они показали, что их концентрация значительно выше (p < 0,0001), чем концентрация нанотилакоидных структур из контрольной группы, которую составляли тилакоиды, завернутые в обычную липидную мембрану.
Затем ученые исследовали взаимодействие мембран клетки реципиента и нанотилакоидных структур, покрасив их интеркалирующими липидными красителями. Оказалось, что мембрана нанотилакоидных структур после инкубации сливается с мембраной клетки-реципиента. Эти результаты подтверждают, что нанотилакоидные структуры попадают в клетку путем эндоцитоза, в ходе которого мембрана везикулы сливается с мембраной захватывающей ее клетки, и содержимое везикулы попадает внутрь.
После получения нанотилакоидных структур и проверки эффективности их захвата клетками-реципиентами, ученые стали измерять эффекты, которые эти системы оказывают на хондроциты. Введя нанотилакоидные структуры в хондроциты и облучив их светом, исследователи измерили уровень молекул АТФ и НАДФН в этих клетках — и установили, что уровень этих молекул в таких клетках значительно выше по сравнению с контрольными группами (которые составляли клетки без нанотилакоидных структур и клетки с нанотилакоидными структурами, не подвергшиеся облучению светом).
Далее ученые решили проверить влияние такого «лечения» на модели клеток. Для того чтобы смоделировать такое патологическое состояние, ученым было необходимо вызвать клеточный стресс и нарушить внутриклеточный метаболизм, для чего они обработали хондроциты интерлейкином 1β (IL-1β). Далее ученые ввели в клетки нанотилакоидные структуры и облучили их светом (контрольные группы остались такими же, как в предыдущем эксперименте). Оказалось, что после облучениях светом уровни АТФ и НАДФН значительно выросли и стали примерно такими же, как у клеток, которые не подвергались обработке IL-1β (то есть тех, у которых метаболизм не был нарушен).
Затем ученые перешли к проверке эффективности своей технологии лечения на живых мышах. Для этого они использовали широко распространенную модель для изучения остеоартрита — мышам проводили хирургическую операцию, при которой им повреждали суставы, что впоследствии приводило к развитию болезни.
После проведения такой операции исследователи произвели мышам инъекцию нанотилакоидных структур в разрушенные хрящи, после чего облучили их светом. Ученые обнаружили, что после инъекции состояние хрящей у мышей стало значительно лучше по сравнению с контрольной группой (оценка проводилась с помощью окраски хрящей иммуногистологическим красителем).
Затем ученые оценили эффективность работы нанотилакоидных структур, проведя рентгеновскую микротомографию хрящей коленных суставов мышей, прошедших двухнедельное лечение. Оказалось, что состояние хрящей на морфологическом уровне у мышей, прошедших лечение, также значительно лучше.
Наконец, исследователи измерили в хрящевых клетках мышей концентрации ATP и NADPH и показали, что уровень этих молекул выше у мышей, прошедших лечение, по сравнению с контрольными группами.
Таким образом, ученые разработали и предложили уникальный способ лечения остеоартрита. Вместо того чтобы искусственным образом модифицировать клеточный метаболизм, ученые использовали готовую фотосинтетическую систему — разработанную и откалиброванную природой в ходе миллиардов лет эволюции — и внедрили ее в животные клетки, обеспечив тем самым их корректное функционирование. Исследователи считают, что эту технологию в дальнейшем можно будет оптимизировать для лечения других болезней, связанных с изменением метаболизма.
Мы уже писали про методы лечения остеоартрита — хоть и более традиционные. Ученые применяли для этого антитела, антидепрессанты и нестероидные противовоспалительные средства (последние, правда, сделали ситуацию только хуже).
Она оказалась эффективнее обычных панорамных мониторов
Американские исследователи разработали иммерсивную систему виртуальной реальности для мышей. Она должна помочь в проведении нейробиологических и поведенческих исследований. Препринт работы доступен на ресурсе Research Square. VR-системы для лабораторных животных сделали возможными фундаментальные нейрофизиологические исследования сложных когнитивных функций. В таких исследованиях необходима фиксация головы для записи активности мозговых структур, которая невозможна, если животное бежит по лабиринту или выполняет другие активные задачи. Кроме того, VR позволяет симулировать невозможные в реальном мире условия, такие как телепортация или разобщение движений с визуальной картиной. Существующие системы обычно представляют собой панорамные экраны для проекторов или светодиодные дисплеи, расположенные в 10–30 сантиметрах от глаз мыши, чтобы оставаться в фокусе ее зрения. Такие установки сложны, громоздки и дорогостоящи, их сложно встроить во многие системы нейровизуализации. Кроме того, экспериментальное оборудование (например, камеры, объективы микроскопов, детекторы лизания) может заслонять часть экрана от животного, что уменьшает эффект погружения. Чтобы устранить эти недостатки, Мэттью Айзексон (Matthew Isaacson) с коллегами по Корнеллскому университету разработали бинокулярную VR-систему, которая подает изображения прямо на глаза мыши с двух круглых светодиодных дисплеев через линзы Френеля. Расстояние от 2,76-сантиметрового дисплея до 1,27-сантиметровой линзы составляет сантиметр, от линзы до глаза — 1,5 миллиметра; вся конструкция размещена в 3D-печатном корпусе, изолирующем глаза от внешней среды. Сферическое искажение дисплеев линзой обеспечивает почти постоянное угловое разрешение 1,57 пикселя на градус и частоту Найквиста 0,78 цикла на градус, что выше остроты мышиного зрения. Бинокулярное горизонтальное поле зрения составляет 230 градусов с примерно 25-градусным перекрытием правого и левого полей. Также разработан монокулярный вариант системы с полем зрения 140 градусов. Голова животного фиксирована, при этом оно может свободно передвигаться, вращая трекбол, который наряду с датчиком поискового лизания служит устройством ввода. Информацию от них обрабатывает компьютер Raspberry Pi с установленным игровым движком Godot, он соединен с мониторами по интерфейсу SPI и с диспенсером лакомства-вознаграждения — по USB. Устройство, получившее название MouseGoggles, способно генерировать VR-сцены с частотой 80 кадров в секунду и задержкой между вводом и выводом менее 130 миллисекунд. В качестве испытаний системы исследователи проводили монокулярную стимуляцию анестезированной мыши с фиксированной головой одновременно с двухфотонной визуализацией токов кальция (GCaMP6s) в ее зрительной коре. Дисплей производил на 99,3 процента меньше светового загрязнения, чем стандартный светодиодный монитор, что позволяло проводить флуоресцентную визуализацию без дополнительных фильтров или экранирования. Медианный радиус рецептивного поля составил 6,2 градуса; контраст по полунасыщенности — 31,2 процента; максимальный нейроответ наблюдался при пространственной частоте 0,042 цикла на градус. Бинокулярную систему успешно испытали в ходе записи электрических импульсов от CA1-нейронов гиппокампа. Для проверки формирования условных рефлексов с помощью VR-системы мышей в течение пяти дней тренировали в замкнутом линейном виртуальном пространстве, где им на некоторых участках давали лакомство. Рефлекс вырабатывался хорошо — подходя к заданным местам, животные начинали облизываться в предвкушении угощения, на остальных участках интенсивность поискового лизания была значительно снижена. Когда животным, впервые помещенных в MouseGoggles, демонстрировали внезапно появляющийся объект, большинство из них сразу демонстрировали реакцию испуга — быстро отдергивались или отпрыгивали с выгнутой спиной и поджатым хвостом. При использовании обычных мониторов этого не происходило, а значит, система обеспечивает более глубокое погружение в виртуальную реальность, заключили исследователи. https://www.youtube.com/watch?v=YFkAKO795Ro Мышь в MouseGoggles и реакция испуга на появляющийся объект Чтобы повысить доступность MouseGoggles, авторы использовали недорогие (общая стоимость менее 200 долларов США) и легкие для сборки неспециалистами компоненты. Описание, программное обеспечение и подробная документация выложены в открытый доступ. Ранее для более глубокого погружения мышей в виртуальную реальность разные команды разработчиков предлагали дополнить систему имитирующими стены пластинами, которые животное может ощущать вибриссами, или создавать специальные помещения с высокочувствительными камерами.