Длинная некодирующая РНК облегчила течение фенилкетонурии у мышей
Биологи из пяти стран сообщили в Science об успешном лечении мышей с фенилкетонурией с помощью длинной некодирующей РНК, которая смогла увеличить у животных активность фермента фенилаланингидроксилазы и снизить у них в крови уровни фенилаланина.
Фенилкетонурия — наследственное заболевание, связанное с резким снижением или полным отсутствием активности печёночного фермента фенилаланингидроксилазы, который катализирует превращение фенилаланина в тирозин. Из-за этого в организме накапливается фенилаланин и его токсичные производные. Болезнь сопровождается прогрессированием умственной отсталости, и чтобы предотвратить ее развитие, детям с рождения приходится соблюдать строгую диету, исключающую продукты с фенилаланином. Хотя ученые постоянно разрабатывают новые методы лечения этого заболевания, ни один из них еще не одобрили для лечения людей.
Исследователи из Германии, США, Тайваня, Франции и Швейцарии во главе с Люцин Ян (Liuqing Yang) из Университета Техаса изучали длинные некодирующие РНК (днкРНК), которые не несут информации о белках, но регулируют их синтез и экспрессию генов. Ученые обнаружили днкРНК в печени мышей, которая увеличивает активность фенилаланингидроксилазы. Эту длинную некодирующую РНК назвали Pair (PAH-activating lincRNA). У мышей, у которых эта днкРНК не работала, наблюдались симптомы, сходные с фенилкетонурией. Тогда исследователи задумались о том, как использовать это открытие, чтобы помочь больным с фенилкетонурией. Они нашли аналог днкРНК Pair у человека, которая называет HULC.
Оказалось, что Pair и HULC функционируют в клетках как мышей, так и человека, поэтому одну днкРНК можно заменить на другую. Биологи сконструировали РНК, кодирующую фрагмент последовательности HULC, помеченную N-ацетилгалактозамином для облегчения доставки в клетки печени. Конструкцию испытали на мышах с мутацией R408W гена фенилаланингидроксилазы. У пациентов с этой мутацией болезнь обычно плохо поддается контролю.
В обеих экспериментальных группах, различающихся только длительностью лечения (3 и 12 дней), у животных снизилась концентрация фенилаланина в крови. Его уровень также сохранился относительно небольшим и при внесении дополнительного фенилаланина в пищу.
Лечение с помощью длинных некодирующих РНК имеет преимущества по сравнению с другими РНК-методами: днкРНК можно более свободно модифицировать, так как у них нет особых требований к последовательности, а это повышает их стабильность, снижает иммунногенность и вероятность нежелательных эффектов. Вместе с тем, перед учеными еще стоит задача, оптимизировать методы доставки днкРНК прицельно в разные ткани. Это позволит лечить множество заболеваний, поражающих разные органы.
Несколько лет назад исследователи применили для лечения больных фенилкетонурией мышей технологию CRISPR/Cas. С помощью нее удалось исправить точечную мутацию в ДНК клеток печени у взрослых мышей, в результате чего они вылечились.
Анастасия Кузнецова-Фантони
Исследование провели на личинках дрозофил
Японские исследователи в экспериментах с дрозофилами установили механизм влияния на нейропластичность фермента убиквитинлигазы, функции которого нарушены при синдроме Ангельмана. Как выяснилось, этот фермент в пресинаптических окончаниях аксонов отвечает за деградацию рецепторов к костному морфогенетическому белку, за счет чего устраняются ненужные синапсы в процессе развития нервной ткани. Отчет о работе опубликован в журнале Science. Синдром Ангельмана представляет собой нарушение развития, которое проявляется умственной отсталостью, двигательными нарушениями, эпилепсией, отсутствием речи и характерной внешностью. Его причиной служат врожденные дефекты фермента убиквитинлигазы Е3А (Ube3a), который присоединяет к белкам убиквитин, влияющий на их судьбу в клетке, в том числе деградацию. При синдроме Ангельмана сниженная активность Ube3a нарушает синаптическую пластичность в процессе нейроразвития, в частности элиминацию ненужных синапсов. Повышенная активность этого фермента, напротив, приводит к неустойчивости сформировавшихся синапсов и, как следствие, к расстройствам аутического спектра. Исследования постсинаптических функций Ube3a показали, что он играет роль в нейропластичности, в частности формировании дендритных шипиков. При этом, по данным иммунохимических и электронно-микроскопических исследований, в коре мозга мыши и человека этот фермент экспрессируется преимущественно пресинаптически. Учитывая высокую эволюционную консервативность Ube3a, сотрудники Токийского университета под руководством Кадзуо Эмото (Kazuo Emoto) использовали для изучения его пресинаптических функций сенсорные нейроны IV класса по ветвлению дендритов (C4da) личинок плодовой мухи дрозофилы. Число дендритов этих нейронов резко сокращается (происходит их прунинг) в первые 24 часа после образования куколки, а на последних стадиях ее развития дендриты разветвляются вновь уже по взрослому типу. Используя флуоресцентные метки различных биомаркеров нейронов, исследователи показали, что в ходе этого процесса ремоделированию подвергаются не только дендриты, но и пресинаптические окончания аксонов. Попеременно отключая разные компоненты участвующих в этих процессах молекулярных комплексов, ученые убедились, что для элиминации синапсов под действием сигнального пути гормонов линьки экдизонов необходима только Ube3a, но не куллин-1 E3-лигаза, участвующая в прунинге дендритов. Дальнейшие эксперименты с применением флуоресцентных меток и РНК-интерференции показали, что Ube3a активно транспортируется из тела нейрона в аксон двигательным белком кинезином со средней скоростью 483,8 нанометра в секунду. Создав мутантов с дефектами в различных участках Ube3a, авторы работы выяснили, что связанные с синдромом Ангельмана мутации D313V, V216G и I213T в среднем домене фермента, содержащем тандемные полярные остатки (TPRs), препятствуют его связи с кинезином и транспорту из тела нейрона в аксон. Как следствие, нарушается элиминация ненужных синапсов. Изменения в N-концевом цинк-связывающем домене AZUL и C-концевом HECT влияли на эти процессы в значительно меньшей степени. Ube3a принимает участие в убиквитинировании многих клеточных белков. Чтобы выяснить, какой из них опосредует элиминацию синапсов, авторы работы вызывали в нейронах избыточную экспрессию разных белков-мишеней Ube3a с целью насытить этот фермент и таким образом заблокировать его действие. Оказалось, что выраженные дефекты элиминации синапсов возникают при избыточной экспрессии тиквеина (Tkv) — пресинаптического рецептора к костному морфогенетическому белку (ВМР); прунинг дендритов при этом не затрагивается. Исследование нормальной экспрессии Tkv с помощью флуоресцентных меток показало, что ее уровень значительно снижается через восемь часов после начала формирования куколки. У мутантов, лишенных Ube3a, этого не происходило. Выключение гена tkv или другого компонента сигнального пути BMP — mad — восстанавливало элиминацию синапсов у таких мутантов, то есть за нее отвечает именно этот сигнальный путь. Это подтвердили, восстановив элиминацию синапсов у мутантов без Ube3a антагонистом BMP LDN193189, а также экспрессией белков Glued-DN или Dad, которые подавляют сигнальную активность Mad. Искусственное повышение пресинаптической экспрессии Ube3a в нейронах C4da вызывало массированную преждевременную элиминацию сформировавшихся синапсов и общее уменьшение синаптической передачи у личинок третьего возраста. Это происходило из-за чрезмерного подавления сигнального пути BMP. Таким образом, дефекты убиквитинлигазы Ube3a, лежащие в основе синдрома Ангельмана, приводят к избыточной активности сигнального пути BMP, вследствие чего не происходит устранение ненужных синапсов в процессе развития нервной системы. Этот сигнальный путь может послужить мишенью для разработки новых методов лечения этого синдрома, а возможно и расстройств аутического спектра, считают авторы работы. В 2020 году американские исследователи сообщили, что им удалось предотвратить развитие синдрома Ангельмана у мышей с мутацией материнской копии гена UBE3A. Для этого они с помощью системы CRISPR/Cas9 инактивировали длинную некодирующую РНК UBE3A-ATS, которая подавляет экспрессию отцовской копии UBE3A.