Замена нескольких кодонов на синонимичные защитила бактерии от вирусов

Биологи создали штамм кишечной палочки, в котором сразу несколько кодонов заменили на синонимичные, а соответствующие транспортные РНК вовсе удалили из клеток. Измененные бактерии стали устойчивы к действию бактериальных вирусов. Затем ученые внесли в геном кишечной палочки гены, кодирующие новые транспортные РНК, и бактерии стали встраивать в полипептидные последовательности неканоничные аминокислоты. В результате биологи создали новый штамм, потенциально применимый в производстве: такие бактерии не смогут пострадать от заражения вирусами, и при этом способны производить больший спектр химических соединений. Работа опубликована в Science.

В генетическом коде единица измерения – кодон, последовательность из трех нуклеотидных остатков, которые обозначают начало синтеза полипептида, включение определенной аминокислоты в последовательность или сигнализируют об остановке синтеза. В природе используется 64 кодона (триплета), и большинство аминокислот кодируются сразу несколькими из них. В процессе трансляции (синтеза полипептидной цепи) транспортные РНК, несущие на себе ту или иную аминокислоту, распознают соответствующий ей кодон в матричной РНК. Если убрать некоторые транспортные РНК из клетки, то соответствующие кодоны в ее геноме станут нечитаемыми. Ученые ранее предполагали, что таким образом можно будет создать клетку с новыми свойствами, например, с устойчивостью к вирусам (фагам). Это свойство очень понадобилось бы в биотехнологическом производстве: бактерии в биореакторах оказались бы защищены от поражения фагами. Кроме того, лишив некоторые кодоны смысла, можно придать им новый – и заставить клетки производить гетерополимеры с неканоническими аминокислотами. Однако эти гипотезы еще не тестировали экспериментально. 

До этого ученые показывали на клетках кишечной палочки E. coli, что удаление из генома последовательности, кодирующей один из трех белков-факторов терминации (RF1), увеличивает устойчивость бактерий к некоторым фагам: в результате такой модификации триплет TAG просто перестает быть стоп-кодоном (сигналом об окончании синтеза полипептидной цепи). Однако TAG редко используется фагами для остановки трансляции, и даже в отсутствие RF1 бактериальные вирусы продолжают производить свои копии, тем более что нечитаемость стоп-кодона не мешает синтезу вирусных белков полной длины. В то же время триплеты, кодирующие аминокислоты, как минимум в десять раз более распространены в вирусных геномах. Ученые предположили, что в неспособных прочитать какой-либо из таких кодонов клетках вирусы будут намного менее активно реплицироваться. Кроме того, используя освободившиеся кодоны, можно зашифровать в генетическом коде непривычные для клетки мономеры, а не аминокислоты. В теории, так можно закодировать и полимеры, полностью состоящие из неканонических мономеров.

Ранее в одной из работ ученые из Кембриджского университета под руководством Джейсона Чина (Jason Chin) устранили избыточность генетического кода в бактерии E. coli, заменив несколько кодирующих аминокислоту серин кодонов на синонимичные. Полученный штамм исследователи назвали Syn61.

В новой работе исследователи использовали этот «синтетический» штамм кишечной палочки. Ученые предположили, что если заменить кодоны TCA, TCG и TAG на синонимичные, можно одновременно в одной клетке удалить гены, которые кодируют подходящие к ним транспортные РНК. Исследователи удалили из клеток сразу несколько транспортных РНК и фактор терминации, который завершает трансляцию. Полученный таким образом штамм кишечной палочки оказался жизнеспособен, но рос в 1,7 раза медленнее. Скорость роста удалось нормализовать при помощи случайного мутагенеза, который, впрочем, не обратил вспять внесенные учеными изменения в генетическом коде. Новый штамм биологи назвали Syn61∆3.

Авторы работы выяснили, что изменения действительно защищают бактерии от вирусов: в измененных клетках не формировались новые вирусные частицы, и вирусная инфекция не влияла скорость роста бактерий. Этот эффект сохранялся даже при добавлении в культуру бактерий целого «коктейля» из нескольких видов фагов.

Далее ученые попробовали зашифровать в геноме бактерий полипептидные последовательности с неканоничными аминокислотами. Для этого исследователи экспрессировали ген убиквитина, содержащий кодоны TCG, TCA или TAG в самом начале последовательности (11 позиция). Одновременно ученые снабдили бактерии генами транспортных РНК, которые распознают эти кодоны и доставляют к месту трансляции неканоничные аминокислоты. В отсутствие этих аминокислот в питательной среде, в клетках не синтезировался убиквитин. Когда же в среду добавляли необходимые мономеры, убиквитин производился клетками на уровне, сопоставимом с таковым у не измененных клеток. Масс-спектрометрия полученного белка также показала, что на одиннадцатой позиции действительно присутствует та самая неканононичная аминокислота. В дополнительных экспериментах ученые показали, что можно вставлять неканоничные аминокислоту и сразу в нескольких позициях в белке. Также ученые успешно встроили в пептид три разные неканоничные аминокислоты в разных позициях в белке.

Наконец, исследователи попробовали зашифровать в геноме бактерий полимерные последовательности, полностью состоящие из трех пар различных неканоничных аминокислот. По-разному комбинируя мономеры, ученые синтезировали 22 варианта гексамеров и октамеров в составе полипептидов. Авторы работы затем смогли отдельно очистить синтетические последовательности. И напоследок, ученые смогли подобным образом заставить клетки производить неприродные макроциклы, которые напоминают нерибосомные пептиды бактерий.

Про то, как группа Джейсона Чина создавала штамм Syn61, на основе которого выполнена эта работа, можно прочитать в заметке N + 1. Ученые не впервые переписывают генетический код бактерий: ранее команде Джорджа Черча удавалось заменить семь кодонов в бактериальном геноме на синонимичные. 

Вера Сысоева