Синтетической кишечной палочке урезали генетический код
Биологи создали штамм кишечной палочки Escherichia coli, геном которой был целиком синтезирован заново. При этом в ее геноме полностью заменили три кодона на синонимичные, таким образом, сократив генетический код с 64 до 61 позиции. Если геном первого организма с синтетическим геномом содержал «всего» миллион пар оснований, на сей раз эту цифру удалось превысить в четыре раза, констатируют авторы статьи в Nature.
В 2010 году команда Крейга Вентера заявила о создании первого организма с полностью синтетическим геномом. Организм представлял собой штамм бактерии Mycoplasma mycoides, который был получен путем введения в клетку-реципиента хромосомы, полностью синтезированной in vitro. Размер синтетической хромосомы составил чуть больше одного миллиона пар оснований. После этого эксперимента биологи смогли также синтезировать и собрать несколько искусственных дрожжевых хромосом, сопоставимых по размеру.
Коллектив ученых из лаборатории молекулярной биологии Кембриджа под руководством Томаса Эллиота (Thomas Elliott) и Джейсона Чина (Jason Chin) создал штамм кишечной палочки с синтезированной de novo хромосомой размером 4 миллиона пар оснований. Собрать такой огромный геном удалось только по частям прямо в клетках «хозяина», благодаря способности E. coli рекомбинировать ДНК с высокой эффективностью.
Для синтеза и сборки фрагментов геном штамма кишечной палочки MDS42 разбили на 37 перекрывающихся фрагментов, каждый размером чуть больше 100 тысяч пар оснований. Каждый такой кусок собрали из меньших кусочков при помощи рекомбинации в дрожжевых клетках (так же, как это было сделано в работе Вентера). Полученные синтетические фрагменты ввели в составе плазмид в клетки MDS42 и при помощи модифицированного метода REXER, основанного на гомологичной рекомбинации, заставили клетки хозяина обменять фрагмент своей хромосомы на фрагмент синтетической.
После нескольких раундов рекомбинации ученые получили семь различных штаммов, содержащих семь больших частей синтетической хромосомы в составе своего генома. Затем в клетках индуцировали процесс конъюгации — аналог полового процесса у бактерий, в ходе которого возможен обмен генетической информацией. Это позволило исследователям последовательно скомбинировать отдельные фрагменты синтетической хромосомы в одном штамме. Полученный «синтетический» штамм E. coli получил название Syn61.
По задумке авторов его главной отличительной особенностью стал нестандартный генетический код. В ходе синтеза частей генома кодоны TCG и TCA, кодирующие аминокислоту серин, были исключены из генетического кода и заменены на синонимичные кодоны, также кодирующие серин. Это стало возможным благодаря вырожденности генетического кода — так как каждой аминокислоте соответствует кодон из трех букв, а букв всего четыре, 20 аминокислот кодируются при помощи 64 кодонов (сюда также входят три стоп-кодона, обозначающие конец белковой последовательности). Для серина при этом отводится целых шесть кодонов.
Кроме лишних кодонов серина, ученые удалили из кода кишечной палочки один из стоп-кодонов — все кодоны TAG были заменены на TAA. Генетический код организма Syn61, таким образом, состоит из 61 кодона вместо 64.
Всего в синтетической хромосоме оказалось заменено 18214 кодонов. Ранее исследователям удавалось исключить один из стоп-кодонов из кода при помощи рекомбинации с мутантными олигонуклеотидами, но для этого пришлось поменять максимум 321 кодон.
Тесты показали, что штамм Syn61 вполне нормально себя чувствует и растет всего лишь в 1,6 раза медленнее, чем предковый штамм MDS42. Как выяснилось, изменение генетического кода сделало некоторые гены ненужными, например ген одной из тРНК для серина, который ранее был жизненно важен для кишечной палочки.
Как поясняют исследователи, данная работа демонстрирует принципиальную возможность существования жизни с урезанным генетическим кодом. Кроме того, отработанные технологии сборки генома приближают ученых к созданию организмов с заданными свойствами, например,
в состав белков не встречающиеся в природе аминокислоты. Мы уже
о подобных экспериментах, где бактерий заставляли синтезировать новые белки путем, наоборот, расширения генетического кода при помощи введения в генетический алфавит новых букв.
Ее произвели макрофаги в верхнем шейном нервном узле
Немецкие и американские исследователи пришли к выводу, что расстройства сна при хронических заболеваниях сердца связаны с нарушением симпатической иннервации шишковидного тела, вырабатывающей мелатонин, связанными с сердцем провоспалительными иммунными клетками. Публикация об этом появилась в журнале Science. У людей и других млекопитающих смену периодов сна и бодрствования контролирует секреция мелатонина, синхронизированная с 24-часовым циклом смены дня и ночи на Земле. Этот гормон вырабатывает шишковидное тело (эпифиз), расположенное в надталамической области головного мозга, в ответ на уровень симпатической иннервации из верхнего шейного узла. Помимо эпифиза и некоторых других органов этот узел иннервирует и сердце. Известно, что при хронических сердечных заболеваниях зачастую снижается уровень мелатонина и возникают сопутствующие нарушения сна, которые негативно сказываются на течении болезни и качестве жизни пациента. Механизмы этого явления изучены не были, при этом они могли бы дать почву для разработки новых методов лечения. Чтобы разобраться в этом вопросе, сотрудники различных научных центров Германии и США под руководством Штефана Энгельхардта (Stefan Engelhardt) из Мюнхенского технологического института изучили посмертные препараты эпифизов семи человек с кардиологическими заболеваниями и девяти без них. Оказалось, что при болезнях сердца значительно снижена плотность аксонов (то есть иннервация) в этой железе. Выяснив это, авторы работы перешли к экспериментам на мышах с двумя искусственно вызванными заболеваниями сердца: перегрузкой левого желудочка давлением путем хирургического сужения аорты и сердечной недостаточностью с сохранной фракцией выброса. Уровень мелатонина у таких животных был снижен, что сопровождалось нарушениями циркадианных ритмов. Генетическая маркировка помогла выявить у них резкое снижение симпатической иннервации эпифиза без нарушения его внутренней структуры и анатомического окружения. Морфометрическое и гистологическое исследование верхнего шейного узла продемонстрировало его значительную гипертрофию с замещением фиброзной соединительной тканью, что свидетельствует о тяжелом, возможно необратимом повреждении органа. Аналогичные изменения исследователи увидели на посмертных препаратах верхних шейных узлов кардиологических пациентов — рубцовая ткань замещала до 70 процентов их объема. При этом степень поражения узла значительно коррелировала со степенью ремоделирования миокарда в результате заболевания. Это подтвердили у живых пациентов с помощью УЗИ, а также обнаружили у них связь размеров верхнего шейного узла с фракцией выброса (функциональным показателем сердечной деятельности). После этого авторы работы выполнили секвенирование РНК одиночных клеток и ядер верхнего шейного узла мышей с кардиологическими заболеваниями, а также иммуногистохимическое окрашивание разных пулов его клеток и нервных связей с эпифизом. Выяснилось, что симпатическая иннервация железы значительно снижалась еще до декомпенсации сердечной недостаточности, и что при этом узел инфильтрирован провоспалительными макрофагами. В нервных узлах, не иннервирующих сердце, подобной инфильтрации не наблюдалось, уровни биомаркеров общего воспаления повышены не были, что свидетельствует о связи этих макрофагов именно с заболеванием сердца. Схожую картину удалось пронаблюдать и в посмертных образцах кардиологических пациентов. Транскриптомное профилирование межклеточных взаимодействий в верхнем шейном узле мышей на ранних стадиях болезни сердца показало, что сильнее всего нарушены связи между макрофагами и симпатическими нейронами, иннервирующими шишковидное тело. Еженедельные инъекции ингибитора макрофагов клодроната в этот узел сразу после операции по сужению аорты предотвращали денервацию железы и снижение уровня мелатонина. Эксперименты по совместному выращиванию клеток на питательной среде, подтвердили, что центральную роль в гибели симпатических нейронов играют активированные провоспалительные макрофаги. В 2020 году французские ученые обнаружили, что если люди засыпают позже привычного времени, то во время сна и на следующий день пульс у них значительно превышает норму. То же происходит и при засыпании на более чем полчаса раньше обычного, однако пульс при этом возвращается к норме уже через несколько часов сна. Годом позже британские исследователи показали, что с наименьшим риском сердечно-сосудистых заболеваний связан отход ко сну между 22 и 23 часами.