Российские химики создали самый маленький флуороген-активирующий белок

Российские ученые изучили структуру одного флуороген-активирующего белка, который активно применяют как инструмент для биомолекулярных исследований, и нашли способ его уменьшить. В результате авторы получили самый маленький в мире флуороген-активирующий белок, что делает его еще более удобным в использовании. Работа опубликована в Chemical Science.

Флуоресцентные метки часто используются в биологии для изучения структуры клеток, а также биологических процессов на клеточном уровне. Большое количество таких меток — флуорецсентные белки. Ученые вносят в клетки гены этих белков, и сами клетки начинают производить необходимые метки по предоставленной инструкции. Иногда применяются и химические метки из малых молекул (красок), которые флуоресцируют в ответ на связывание с чем-либо или в результате химической реакции. Однако и у тех, и других есть свои ограничения в использовании — флуоресцентные белки достаточно большие, и им требуется время на созревание в присутствии кислорода, а краски нередко помечают не только целевые объекты.

С этой точки зрения обещающими инструментами выглядят флуорогены: вещества (краски) с очень слабой флуоресценцией в свободном состоянии, которые становятся очень яркими, как только связываются с еще одним компонентом, например, активирующим флуороген белком. Таким меткам не нужен кислород для созревания, и их можно использовать для исследований в анаэробных условиях. Флуоресцентным сигналом этих меток можно управлять, добавляя или смывая сам флуороген. Еще одна важная характеристика — размер: чем метка меньше, тем меньше она влияет на природную динамику исследуемой системы. Флуороген-активирующие белки, как правило, в два раза меньше флуорецсентных белков.

Один из таких активирующих белков был разработан на основе бактериального фоторецептора. Замена нескольких аминокислотных остатков позволила его использовать как активатор для группы флуорогенов. Однако структура этого белка оставалась неизвестной.

Ученые из Института биоорганической химии РАН под руководством Михаила Баранова при помощи ЯМР-спектроскопии изучили структуру этого белка в свободной форме и в комплексе с краской-флуорогеном. Исследователи заметили, что часть белка на его N-конце не имеет четкой структуры в свободном состоянии и меняет форму, только когда с белком связывается краска. Ученые предложили, что поскольку процесс связывания флуорогена начинается еще до изменения структуры N-конца, то, возможно, активировать флуорецсенцию краски белок может и без этой части.

Авторы укоротили молекулу на 26 аминокислотных остатков. «Карман» для связывания краски увеличился, и белок не смог активировать ранее описанные в литературе флуорогены. Тогда исследователи составили библиотеку новых вариантов красок и выбрали ту, которая подошла к укороченному белку. Таким образом, ученые создали самый маленький в мире функциональный флуороген-активирующий белок, состоящий всего из 98 аминокислотных остатков. Флуоресценция краски после связывания с новым белком увеличивается больше чем в 100 раз, квантовый выход составляет 55 процентов, а константа связывания близка к 1 микромолю — по всем этим параметрам белок похож на своего предшественника.

Авторы работы также показали новый белок в работе: трансфицировали им клетки, при этом к белку добавили последовательности, заставляющие его локализоваться на той или иной структуре в клетке. Возникающая при добавлении флуорогена локальная флуоресценция позволяет визуализировать строение клетки.

Ученые показали, что краска связывается с белком нековалентно, и ее легко можно смыть с клеток и добавить заново.

Ранее ученые случайно создали краску для наблюдения за процессом клеточного транспорта: вместо флуоресценции в ответ на окислительный стресс изучаемая молекула стала кристаллизоваться вслед за движением кинезина.

Вера Сысоева