CAR-Т-лимфоцитам предложили давать отдых
Американские ученые предложили периодически подавлять активность Т-лимфоцитов с химерными антигенными рецепторами (CAR) фармакологически или с помощью генетического выключателя, то есть давать им своеобразный отдых. Как следует из публикации в журнале Science, это помогает эффективно бороться с истощением клеток и, следовательно, поддерживать их функциональность в течение длительного времени.
Принцип технологии химерных антигенных рецепторов (сhimeric antigen receptor, CAR) состоит в том, что у собственных цитотоксических Т-лимфоцитов человека заменяют основной рецепторный комплекс, неспецифически распознающий чужеродные клетки, на искусственный CAR, специфичный по отношению к конкретному виду рака. Химерным такой рецептор называют, поскольку он состоит из разных по происхождению модулей: фрагмента моноклонального антитела (scFv) для распознавания опухолевого антигена, внутриклеточного активирующего домена (CD3ζ) и ряда вспомогательных трансгенов. Для получения CAR-Т-лимфоцитов из крови пациента забирают его собственные клетки, на вирусном векторе внедряют в них ген CAR и вводят обратно в организм. Там эти лимфоциты распознают опухоль и активируются, атакуя ее и выделяя цитокины, привлекающие различные иммунные клетки. Подробнее о технологии CAR можно почитать в нашем материале «Химера против рака».
На сегодняшний день CAR-Т-лимфоциты — наиболее перспективный метод терапии рака, позволяющий добиться полного рассасывания опухолей. Правда, речь идет в основном об онкогематологических заболеваниях, и даже при них примерно у половины пациентов рано или поздно возникают рецидивы. Одна из основных причин недостаточной эффективности CAR-Т-лимфоцитов — истощение этих клеток, при котором они утрачивают эффекторные функции и экспрессируют ингибиторные рецепторы. Относительного успеха в борьбе с этим явлением удавалось достичь довольно сложным методом выключения одного из регуляторных генов.
Ранее Кристал Мэколл (Crystal Mackall) из Стэнфордского университета с коллегами показали, что истощение CAR-Т-лимфоцитов может возникать либо из-за чрезмерной активации при избытке антигенов в опухолевом окружении, либо при тонической активации (постоянном функционировании основных рецепторных сигнальных путей в отсутствие антигена). При этом признаки истощения проявляются и на фенотипическом, и на транскриптомном, и на эпигенетическом уровнях.
Исходя из этого, группа Мэколл предположила, что временное блокирование активности CAR-Т-лимфоцитов — своеобразный отдых — может вернуть им утраченные функции. Чтобы проверить это, в новой работе исследователи встроили в ген химерного рецептора молекулярный выключатель, который позволял этому рецептору функционировать только в присутствии низкомолекулярного соединения. Без него клетка находилась в состоянии отдыха. Помимо этого, для деактивации обычных CAR-Т-лимфоцитов применяли используемый клинически ингибитор тирозинкиназ (ключевых ферментов сигнальных путей CAR) дазатиниб.
Блокада активности CAR-Т-лимфоцитов ex vivo и в организме мышей с имплантированной человеческой злокачественной опухолью предохраняла клетки от тонической активации и появления признаков истощения. Более того, всего четыре дня подобного отдыха вызывали в уже истощенных клетках транскрипционное репрограммирование, эпигенетическое ремоделирование, нормализацию фенотипа и восстановление функций. При этом степень наблюдаемых позитивных эффектов коррелировала с продолжительностью выключения сигнальных путей.
При циклической смене активности и отдыха CAR-Т-лимфоциты эффективнее постоянно «включенных» сдерживали рост опухолей и повышали выживаемость подопытных животных. По мнению авторов работы, внедрение подобных циклических режимов работы CAR-Т-клеток в клиническую практику может существенно повысить эффективность подобной терапии. Тем более, что в самом простом виде осуществить это можно периодическим введением дазатиниба — зарегистрированного лекарственного средства, разрешенного к применению у людей.
Работы по поиску новых областей применения CAR-Т-лимфоцитов и повышения их эффективности ведутся постоянно. Речь идет не только об онкологии, но и лечении вирусных инфекций, и борьбе с клеточным старением.
Исследование провели на личинках дрозофил
Японские исследователи в экспериментах с дрозофилами установили механизм влияния на нейропластичность фермента убиквитинлигазы, функции которого нарушены при синдроме Ангельмана. Как выяснилось, этот фермент в пресинаптических окончаниях аксонов отвечает за деградацию рецепторов к костному морфогенетическому белку, за счет чего устраняются ненужные синапсы в процессе развития нервной ткани. Отчет о работе опубликован в журнале Science. Синдром Ангельмана представляет собой нарушение развития, которое проявляется умственной отсталостью, двигательными нарушениями, эпилепсией, отсутствием речи и характерной внешностью. Его причиной служат врожденные дефекты фермента убиквитинлигазы Е3А (Ube3a), который присоединяет к белкам убиквитин, влияющий на их судьбу в клетке, в том числе деградацию. При синдроме Ангельмана сниженная активность Ube3a нарушает синаптическую пластичность в процессе нейроразвития, в частности элиминацию ненужных синапсов. Повышенная активность этого фермента, напротив, приводит к неустойчивости сформировавшихся синапсов и, как следствие, к расстройствам аутического спектра. Исследования постсинаптических функций Ube3a показали, что он играет роль в нейропластичности, в частности формировании дендритных шипиков. При этом, по данным иммунохимических и электронно-микроскопических исследований, в коре мозга мыши и человека этот фермент экспрессируется преимущественно пресинаптически. Учитывая высокую эволюционную консервативность Ube3a, сотрудники Токийского университета под руководством Кадзуо Эмото (Kazuo Emoto) использовали для изучения его пресинаптических функций сенсорные нейроны IV класса по ветвлению дендритов (C4da) личинок плодовой мухи дрозофилы. Число дендритов этих нейронов резко сокращается (происходит их прунинг) в первые 24 часа после образования куколки, а на последних стадиях ее развития дендриты разветвляются вновь уже по взрослому типу. Используя флуоресцентные метки различных биомаркеров нейронов, исследователи показали, что в ходе этого процесса ремоделированию подвергаются не только дендриты, но и пресинаптические окончания аксонов. Попеременно отключая разные компоненты участвующих в этих процессах молекулярных комплексов, ученые убедились, что для элиминации синапсов под действием сигнального пути гормонов линьки экдизонов необходима только Ube3a, но не куллин-1 E3-лигаза, участвующая в прунинге дендритов. Дальнейшие эксперименты с применением флуоресцентных меток и РНК-интерференции показали, что Ube3a активно транспортируется из тела нейрона в аксон двигательным белком кинезином со средней скоростью 483,8 нанометра в секунду. Создав мутантов с дефектами в различных участках Ube3a, авторы работы выяснили, что связанные с синдромом Ангельмана мутации D313V, V216G и I213T в среднем домене фермента, содержащем тандемные полярные остатки (TPRs), препятствуют его связи с кинезином и транспорту из тела нейрона в аксон. Как следствие, нарушается элиминация ненужных синапсов. Изменения в N-концевом цинк-связывающем домене AZUL и C-концевом HECT влияли на эти процессы в значительно меньшей степени. Ube3a принимает участие в убиквитинировании многих клеточных белков. Чтобы выяснить, какой из них опосредует элиминацию синапсов, авторы работы вызывали в нейронах избыточную экспрессию разных белков-мишеней Ube3a с целью насытить этот фермент и таким образом заблокировать его действие. Оказалось, что выраженные дефекты элиминации синапсов возникают при избыточной экспрессии тиквеина (Tkv) — пресинаптического рецептора к костному морфогенетическому белку (ВМР); прунинг дендритов при этом не затрагивается. Исследование нормальной экспрессии Tkv с помощью флуоресцентных меток показало, что ее уровень значительно снижается через восемь часов после начала формирования куколки. У мутантов, лишенных Ube3a, этого не происходило. Выключение гена tkv или другого компонента сигнального пути BMP — mad — восстанавливало элиминацию синапсов у таких мутантов, то есть за нее отвечает именно этот сигнальный путь. Это подтвердили, восстановив элиминацию синапсов у мутантов без Ube3a антагонистом BMP LDN193189, а также экспрессией белков Glued-DN или Dad, которые подавляют сигнальную активность Mad. Искусственное повышение пресинаптической экспрессии Ube3a в нейронах C4da вызывало массированную преждевременную элиминацию сформировавшихся синапсов и общее уменьшение синаптической передачи у личинок третьего возраста. Это происходило из-за чрезмерного подавления сигнального пути BMP. Таким образом, дефекты убиквитинлигазы Ube3a, лежащие в основе синдрома Ангельмана, приводят к избыточной активности сигнального пути BMP, вследствие чего не происходит устранение ненужных синапсов в процессе развития нервной системы. Этот сигнальный путь может послужить мишенью для разработки новых методов лечения этого синдрома, а возможно и расстройств аутического спектра, считают авторы работы. В 2020 году американские исследователи сообщили, что им удалось предотвратить развитие синдрома Ангельмана у мышей с мутацией материнской копии гена UBE3A. Для этого они с помощью системы CRISPR/Cas9 инактивировали длинную некодирующую РНК UBE3A-ATS, которая подавляет экспрессию отцовской копии UBE3A.