Биологи уличили анаэробные бактерии в клеточном дыхании с помощью Rnf-насоса

Биологи доказали, что бактерии Thermotoga maritima используют мембранный белковый комплекс Rnf для клеточного дыхания — говорится в исследовании, опубликованном Communications Biology. Ученые выделили этот белок из бактериальных клеток и выяснили, что он работает как молекулярный насос — переносит через мембрану ионы Na⁺. Вместе с натриевой АТФ-синтазой комплекс Rnf формирует простую дыхательную цепь.

Клеточное дыхание — это последовательность химических превращений, в ходе которых клетка запасает энергию в виде молекул АТФ. В большинстве клеток эти превращения происходят при помощи ферментов дыхательной цепи. Они запасают энергию в два этапа: сначала молекулы-насосы перекачивают ионы через мембрану, создавая электрический потенциал, после чего заряды проходят обратно, сообщая энергию ферменту АТФ-синтазе, который и создает АТФ. 

В эукариотических клетках дыхательная цепь расположена в мембране митохондрий и насчитывает пять комплексов. Но бактерии-анаэробы порой обходятся всего двумя: одной молекулой-насосом и АТФ-синтазой, которая тоже переносит ионы сквозь мембрану для запасания энергии. В дыхательной цепи бактерии часто используют NAD и ферредоксин — молекулы, которые переносят электроны между «звеньями». Сначала такая молекула восстанавливается, забирая электрон, а потом — окисляется, передавая его дальше в цепь. 

Гены Rnf часто встречаются в геномах бактерий и их продукты до сих пор считались участниками клеточного дыхания у прокариот. На основе биохимических и генетических данных ученые выдвинули гипотезу о том, что эти белки закрепляются в мембране и участвуют в электронном транспорте. Однако выделить фермент и доказать его свойства не удавалось: белок неизбежно деградировал. 

Мартин Кухнс (Martin Kuhns) и Драган Трифунович (Dragan Trifunović) из Франкфуртского института молекулярной биологии предположили, что тот же белок термофильных бактерий может оказаться стабильнее своих молекулярных родственников у других организмов. Для исследования ученые выбрали T. maritima — анаэробную бактерию, которая была впервые обнаружена в горячих водах вблизи итальянского города Вулкано. Идеальная температура для нее — около 80 градусов Цельсия.

В строго анаэробных условиях исследователям удалось выделить фермент со специфической оксидо-редуктазной активностью. В ходе изучения его свойств оказалось, что белок обладает сразу и АТФ-азной активностью, и способностью к окислению и восстановлению NAD. То есть выделенное вещество состояло из двух ферментов: оксидоредуктазы Rnf и АТФ-азы F1F0. Результаты анализа ученые оценили при помощи гель-электрофореза белков.

Предполагаемая масса белка Rnf — 160 килодальтон, то есть в выделенной смеси оказались и мономер белка, и его димер. Масса АТФ-азы F1F0 тоже совпала с теоретической — 550 килодальтон. После разделения соответствующие полоски белков выделили из геля. Чтобы установить, действительно ли суперкомплекс из двух белков участвует в дыхании, работу его компонентов оценили при разных концентрациях ионов. Оказалось, что активность F1F0 растет пропорционально концентрации натрия, а Rnf и вовсе не работает без этого иона. 

Чтобы воссоздать работу суперкомплекса в мембране, ученые встроили его в липосому — специальный мембранный микрошарик. Это оказалось не так просто — ведь белки эффективно работают на высоких температурах, при которых липосомы теряли стабильность. Тогда решено было проводить эксперимент при температуре 45 градусов Цельсия, при которой активность АТФ-азы составляла 65% от оптимальной. В таких условиях липосома оставалась стабильной. 

Биологи хотели показать, что оба белка действительно транспортируют ионы сквозь мембрану. После их встройки исследователи поместили липосомы в раствор с ионами натрия. Затем они добавили субстрат: АТФ для АТФ-азы и NAD для Rnf. В обоих случаях произошел скачок концентрации натрия внутри липосомы. Биологи объясняют это транспортной натрий-зависимой активностью белков. Так Франкфуртские исследователи доказали давнюю гипотезу о функции гена Rnf у бактерий-анаэробов. 

Эти организмы обычно используют в качестве окислителя не кислород, как аэробы, а серу, железо и азот. Но недавно были обнаружены хемосинтезирующие бактерии, которые способны фиксировать углерод за счет энергии окисления марганца. Ученые считают, что они могут замыкать природные циклы марганца и влиять на круговорот других элементов.

Анна Муравьева