Долю человеческих клеток в химере с мышью подняли до четырех процентов
Американским биологам удалось создать химерные зародыши человека и мыши, в которых доля человеческих клеток составила до четырех процентов. В предыдущих экспериментах клетки человека встраивались в такие зародыши плохо, и их не всегда удавалось обнаружить. Прогресс стал возможен благодаря специальной обработке эмбриональных стволовых клеток человека: исследователи «затормозили» их развитие, синхронизировав их состояние с эмбриональными клетками мыши. В результате человеческие клетки проникли в самые разные органы, от печени до сетчатки. Работа опубликована в журнале Science Advances.
Химерные зародыши из разных видов млекопитающих — это не только инструмент для изучения эмбрионального развития, но и перспективная биотехнология. Ученые неоднократно предлагали использовать животных как инкубаторы для выращивания человеческих органов. Такие химерные зародыши уже создавали не только для лабораторных организмов — например, мышей и крыс, — но и с участием человеческих клеток.
Так, несколько лет назад были получены химеры человек-свинья, а летом 2019 года испанские ученые заявили о том, что создали в Китае химеру человек-обезьяна. Правда, все эти зародыши уничтожают на ранних стадиях развития, чтобы избежать этических разногласий. И только летом 2019 года японские ученые получили разрешение на то, чтобы не только вводить клетки человека в эмбрион мыши, но также подсаживать химеру в матку беременных мышей.
Проблема состоит вот в чем: на той стадии развития, когда возможно создание химеры, клетки человека и мыши находятся в разных состояниях. Зародыш мыши в этот момент состоит из наивных эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) — они способны дать начало всем зародышевым, а также некоторым внезародышевым тканям. Клетки человека на этой же стадии называют примированными ЭСК — из них внезародышевые ткани не получатся, поскольку они уже начали дифференцировку.
Сейчас известно несколько способов перевести ЭСК человека из примированного состояния в наивное — это, например, химические ингибиторы или экспрессия определенных генов (мы также рассказывали об одном механическом способе). Но во всех этих случаях эффективность встраивания в постимплантационный зародыш невысока: в химерах человек-свинья удалось заметить лишь отдельные клетки человека, а в химерах человек-мышь их практически не удается разглядеть.
Цзянь Фэн (Jiang Feng) из Нью-Йоркского государственного университета в Баффало и его коллеги предложили еще один способ решения проблемы. Дело в том, что наивность мышиных ЭСК может быть связана с диапаузой — состоянием, при котором развитие эмбрионов тормозится на время, пока мать вынашивает или выкармливает предыдущее поколение детенышей. Известно также, что диапаузу у мышиных эмбрионов можно вызвать, если заблокировать белковый комплекс mTOR, который подстегивает клеточный обмен веществ. Поэтому Фэн с коллегами предположил, что можно обработать человеческие ЭСК блокаторами mTOR и тем самым синхронизировать их с клетками в зародыше мыши.
Для начала исследователи проверили, что выбранный ими метод работает. Они разработали протокол с участием распространенного блокатора mTOR — рапамицина, а также альтернативного блокатора — Torin1. Полученные колонии наивных ЭСК экспрессировали все необходимые маркеры и образовывали опухоли (тератомы) при введении в организм мыши, то есть удовлетворяли критериям эмбриональных клеток. При этом их функциональные свойства изменились: например, они стали лучше делиться. В то время как исходная культура примированных ЭСК увеличилась в 10 раз за 6 дней, культура наивных ЭСК — почти в 1000 раз. Изменения затронули также экспрессию генов и уровень метилирования ДНК.
Затем авторы работы ввели наивные ЭСК человека, экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок, в мышиные морулы — эмбрионы первых дней развития, которые представляют собой просто группу одинаковых клеток. Из химерных морул развились бластоцисты — клеточные шары с рыхлой массой внутри — причем человеческие клетки светились как во внешнем слое, так и во внутреннем. Далее эти бластоцисты подсадили мышам и полученные эмбрионы забирали на анализ вплоть до 17-го дня развития (отсчет с момента оплодотворения). Исследователей интересовало, в какие ткани смогут встроиться клетки человека. В итоге они были обнаружены как в печени (производное внутреннего зародышевого листка, энтодермы), так и в сетчатке (производное внешнего листка, эктодермы), и даже в сердце и костном мозге (производные среднего листка, мезодермы).
Подсчитав долю общей ДНК человека в химерном зародыше, авторы работы обнаружили, что от 0,14 до 4,06 процентов клеток (в зависимости от конкретного зародыша) были человеческими. По сравнению с предыдущими работами, в которых эти клетки с трудом удавалось обнаружить, здесь можно говорить о стабильном встраивании клеток человека в мышиный зародыш после имплантации.
Чтобы избежать этических споров, исследователи проверили: клетки человека не попали в зачатки половых органов мышей (это одно из строгих ограничений на создание таких химер). Что же касается нервной системы, авторы работы отмечают: хоть отдельные клетки там и были обнаружены, в таком скромном количестве и на таких ранних стадиях они не могли внести существенный вклад в формирование мышиного мозга. Тем не менее, их исследование демонстрирует, что принципиальные трудности в создании химерных зародышей — не столько этические, сколько технические, однако их, в отличие от этических, постепенно удается преодолеть.
Ранее мы рассказывали о том, что ученым удалось получить полноценный зародыш мыши из одной соматической клетки. Зародыши человека, тем временем, удалось культивировать in vitro до стадии более двух недель. А у ранних человеческих эмбрионов обнаружили первые признаки старения.
Полина Лосева
И еще четырех видов опухолей
Британские и датские иммунологи обнаружили на цитотоксических T-лимфоцитах рецептор, узнающий одновременно три разных опухолевых антигена. Пациент, у которого были обнаружены эти Т-клетки, смог достичь полной ремиссии меланомы четвертой клинической стадии. Такое строение T-клеточных рецепторов не дает клеткам опухоли ускользнуть от противоопухолевого иммунитета. Похожие типы Т-клеточных рецепторов есть и у здоровых людей, но их роль в противоопухолевом иммунитете пока неясна. Исследование опубликовано в виде статьи в журнале Cell. Клеточная терапия онкологических заболеваний направлена на введение в организм Т-лимфоцитов, узнающих фрагменты белков опухоли, выставляемые клетками на поверхности белков главного комплекса гистосовместимости (HLA-антигенов). Она позволяет добиться ремиссии во многих случаях, при которых другие виды лечения неэффективны. Но врачи часто сталкиваются с ускользанием опухолевого клона от такого иммунитета. Иногда достаточно нескольких месяцев, чтобы опухолевые клетки перестали экспрессировать маркер, который должны были узнавать лимфоциты. Хотя большинство Т-лимфоцитов узнают один эпитоп, некоторая часть из многообразия Т-клеточных рецепторов, образующихся в процессе созревания Т-клеток, узнает не один, а сразу несколько антигенов. Такие клетки есть и у здоровых людей, и у пациентов с аутоиммунными болезнями. Рецепторы, нацеливающие иммунную систему сразу на несколько молекул-мишеней, могли бы повысить эффективность клеточной терапии. Ведь даже если с поверхности опухоли исчезнет один антиген, то иммунный ответ против второго сохранится, и лечение останется эффективным. Шаг в сторону использования этого принципа в терапии сделала группа онкологов и иммунологов из Великобритании и Дании под руководством Эндрю К. Сьюэлла (Andrew K.Sewell) из Университета Кардиффа. На протяжении последних 15 лет они занимаются клеточной терапией меланомы. В рамках клинических исследований врачи забирали у пациентов клетки крови, отбирали среди них Т-лимфоциты, тропные к меланоме, и после культивации in vitro вводили клетки обратно пациентам. В одном из исследований, проведенном в 2011-2014 годах, участвовал пациент с четвертой клинической стадией меланомы, у которого клеточная терапия позволила добиться десятилетней ремиссии болезни (обычно же медианная продолжительность жизни с момента постановки диагноза у таких пациентов не превышает года). Ученые решили детально исследовать, с какими особенностями Т-клеточного ответа это было связано. Как выяснили иммунологи, почти вся противоопухолевая активность лимфоцитов пациента была связана одним лимфоцитарным клоном (его обозначили MEL8), который реагировал in vitro не только на меланому, но и на клетки острого миелолейкоза, опухоли молочной, предстательной и поджелудочной железы от других пациентов с таким же типом HLA-антигена (гаплотип HLA A*02:01, наиболее распространенный в мире). Это было неожиданно, ведь рецепторы этих Т-клеток чувствительны к белку мелану A, специфичному для меланоцитов и происходящих от них опухолей (включая меланому). Авторы создали библиотеку из 936 миллиардов декапептидных последовательностей и оценили in silico сродство рецепторов MEL8 к олигопептидам, связанным с HLA A*02:01. Такой скрининг позволил отобрать 500 пептидов, представленных в протеоме человека. Три из них — участки белков мелана А, BST2 и IMP2 — имели сродство к Т-клеточному рецептору MEL8 in vitro и при этом экспрессировались меланомой. У всех трех декапептидных последовательностей нашлась гомология и на уровне аминокислотной последовательности, и на уровне третичной структуры, что было подтверждено рентгеноструктурным анализом. Т-клетки, у которых есть рецепторы, тропные одновременно к мелану А, IMP2 и BST2, были обнаружены у здоровых добровольцев и у одного пациента с хроническим лимфолейкозом, но их количество было невелико. Обнаруженный вид поливалентного рецептора можно использовать и для лечения других пациентов: исследователи секвенировали последовательность Т-клеточного рецептора и трансдуцировали этой последовательностью другие линии лимфоцитов в рамках своих экспериментов. Следовательно, есть предпосылки для создания эффективной клеточной терапии опухолей или противоопухолевой вакцины. Впрочем, пока невозможно говорить, насколько безопасной было бы такое лечение, ведь исследование британских и датских ученых основано лишь на единичных наблюдениях пациентов с опухолями. Кроме того, распознавание эпитопов Т-клеточным рецептором зависит от варианта HLA.антигена, имеющегося у данного конкретного человека, и распространенность полимодальных Т-клеточных рецепторов у носителей разных вариантов HLA может отличаться. Даже сильного иммунного ответа против клеток меланомы может оказаться недостаточно для победы над болезнью — на эффективность лечения могут влиять такие факторы, как уровень тестостерона.