Клетки человека научили встраивать в белки неканонические аминокислоты
Американские молекулярные биологи заставили кроветворные клетки человека кодировать неклассические аминокислоты и встраивать их в состав белков. Оказалось, что при этом клетки сохраняют способность дифференцироваться и могут выживать в организме мышей. Это может быть полезно, чтобы получать человеческие белки с измененными свойствами — и, например, сразу проверять их фармакологические свойства in vivo. Работа опубликована в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences.
Вписать новую аминокислоту в генетический код не так сложно, как может показаться. Дело в том, что в нашем генетическом коде уже есть свободные «слова» из трех нуклеотидов, которые сами по себе ничего не кодируют. Они служат стоп-кодонами. Как только рибосома, которая строит белок, доходит до такого «бессмысленного слова», она останавливается, и белок считается готовым. И вот таким стоп-кодонам можно искусственно приписать новое значение.
Для того, чтобы у триплета нуклеотидов появилось значение, необходимо, чтобы клетка умела его расшифровывать. Обычно это происходит так: к информационной РНК прилипает транспортная РНК, которая несет на себе нужную аминокислоту. Для стоп-кодонов такой транспортной РНК в клетке нет, но ее можно добавить извне. И придется добавить еще фермент, который соединяет транспортную РНК с неканонической аминокислотой. Тогда клетка будет встраивать новую аминокислоту на место стоп-кодона.
Подобные эксперименты уже ставили на разных организмах, от бактерий до мышей. И вот группа ученых из Института Скриппс под руководством Питера Шульца (Peter Schultz) добралась до клеток человека. В своей работе исследователи заставили один из стоп-кодонов (УАГ) кодировать аминокислоту пирролизин — подобно тому, как это делают некоторые бактерии и археи.
Чтобы добиться своей цели, авторы работы заражали клетки человека вирусным вектором на основе вируса Эпштейна-Барр. Гены вируса были необходимы, чтобы этот участок ДНК продолжал существовать и размножаться внутри ядра. Кроме того, вектор содержал ген транспортной РНК для пирролизина и фермента трансферазы, который соединяет пирролизин с РНК. Наконец, внутри вектора находился ген зеленого флуоресцентного белка с мутацией: один из его кодонов был искусственно заменен на стоп-кодон УАГ. Это необходимо, чтобы проверить эффективность переписывания: если клетка научилась встраивать пирролизин вместо стоп-кодона, то белок получится полноразмерным и будет светиться. Если не научилась, то белок порвется на середине, и свечения не видно.
Сначала ученые опробовали свой метод на клетках эмбриональной почки человека. Как и следовало ожидать, они начали светиться только при добавлении пирролизина. Затем исследователи взяли кроветворные стволовые клетки из пуповинной крови человека. Успешного встраивания они добились примерно у половины клеток, и почти треть из них приобрела способность светиться.
Затем эти клетки подсадили иммунодефицитным мышам, чтобы выяснить, насколько они сохраняют свою жизнеспособность и новые свойства в живом организме. Оказалось, что они в три раза хуже приживаются, чем клетки, в которые не вводили вирусный вектор (9,5 процентов клеток в кровотоке и 27,8 процентов соответственно). Тем не менее, когда ученые увеличили число пересаживаемых клеток, они добились того, что четверть кроветворных клеток в организме мыши оказались человеческими. Около 20 процентов из них продолжали светиться. Затем они проследили, что из этих человеческих клеток получаются разные типы форменных элементов, включая разные виды лейкоцитов, и некоторые из них сохраняют способность к свечению.
Таким образом, авторам работы удалось заставить стволовые клетки человека кодировать неканонические аминокислоты. Этот метод может оказаться полезен, чтобы получать человеческие белки с измененными свойствами — структурой или функциями — для исследований или разработки лекарств. Авторы работы, например, предположили, что иммунные клетки, которые происходят из таких клеток крови, могут производить модифицированные антитела, поэтому было бы интересно проверить реакцию химерных мышей из их эксперимента на какие-нибудь аллергены.
Мы уже рассказывали о том, как молекулярные биологи переписали, а затем урезали генетический код кишечной палочки, добавили в генетический алфавит четыре «буквы» и обнаружили нетрадиционный код у одного паразитического растения. Подробнее о том, как и зачем ученые строят и переписывают геномы организмов, читайте в нашем материале «С правом на переписку».
Полина Лосева
Исследование провели на личинках дрозофил
Японские исследователи в экспериментах с дрозофилами установили механизм влияния на нейропластичность фермента убиквитинлигазы, функции которого нарушены при синдроме Ангельмана. Как выяснилось, этот фермент в пресинаптических окончаниях аксонов отвечает за деградацию рецепторов к костному морфогенетическому белку, за счет чего устраняются ненужные синапсы в процессе развития нервной ткани. Отчет о работе опубликован в журнале Science. Синдром Ангельмана представляет собой нарушение развития, которое проявляется умственной отсталостью, двигательными нарушениями, эпилепсией, отсутствием речи и характерной внешностью. Его причиной служат врожденные дефекты фермента убиквитинлигазы Е3А (Ube3a), который присоединяет к белкам убиквитин, влияющий на их судьбу в клетке, в том числе деградацию. При синдроме Ангельмана сниженная активность Ube3a нарушает синаптическую пластичность в процессе нейроразвития, в частности элиминацию ненужных синапсов. Повышенная активность этого фермента, напротив, приводит к неустойчивости сформировавшихся синапсов и, как следствие, к расстройствам аутического спектра. Исследования постсинаптических функций Ube3a показали, что он играет роль в нейропластичности, в частности формировании дендритных шипиков. При этом, по данным иммунохимических и электронно-микроскопических исследований, в коре мозга мыши и человека этот фермент экспрессируется преимущественно пресинаптически. Учитывая высокую эволюционную консервативность Ube3a, сотрудники Токийского университета под руководством Кадзуо Эмото (Kazuo Emoto) использовали для изучения его пресинаптических функций сенсорные нейроны IV класса по ветвлению дендритов (C4da) личинок плодовой мухи дрозофилы. Число дендритов этих нейронов резко сокращается (происходит их прунинг) в первые 24 часа после образования куколки, а на последних стадиях ее развития дендриты разветвляются вновь уже по взрослому типу. Используя флуоресцентные метки различных биомаркеров нейронов, исследователи показали, что в ходе этого процесса ремоделированию подвергаются не только дендриты, но и пресинаптические окончания аксонов. Попеременно отключая разные компоненты участвующих в этих процессах молекулярных комплексов, ученые убедились, что для элиминации синапсов под действием сигнального пути гормонов линьки экдизонов необходима только Ube3a, но не куллин-1 E3-лигаза, участвующая в прунинге дендритов. Дальнейшие эксперименты с применением флуоресцентных меток и РНК-интерференции показали, что Ube3a активно транспортируется из тела нейрона в аксон двигательным белком кинезином со средней скоростью 483,8 нанометра в секунду. Создав мутантов с дефектами в различных участках Ube3a, авторы работы выяснили, что связанные с синдромом Ангельмана мутации D313V, V216G и I213T в среднем домене фермента, содержащем тандемные полярные остатки (TPRs), препятствуют его связи с кинезином и транспорту из тела нейрона в аксон. Как следствие, нарушается элиминация ненужных синапсов. Изменения в N-концевом цинк-связывающем домене AZUL и C-концевом HECT влияли на эти процессы в значительно меньшей степени. Ube3a принимает участие в убиквитинировании многих клеточных белков. Чтобы выяснить, какой из них опосредует элиминацию синапсов, авторы работы вызывали в нейронах избыточную экспрессию разных белков-мишеней Ube3a с целью насытить этот фермент и таким образом заблокировать его действие. Оказалось, что выраженные дефекты элиминации синапсов возникают при избыточной экспрессии тиквеина (Tkv) — пресинаптического рецептора к костному морфогенетическому белку (ВМР); прунинг дендритов при этом не затрагивается. Исследование нормальной экспрессии Tkv с помощью флуоресцентных меток показало, что ее уровень значительно снижается через восемь часов после начала формирования куколки. У мутантов, лишенных Ube3a, этого не происходило. Выключение гена tkv или другого компонента сигнального пути BMP — mad — восстанавливало элиминацию синапсов у таких мутантов, то есть за нее отвечает именно этот сигнальный путь. Это подтвердили, восстановив элиминацию синапсов у мутантов без Ube3a антагонистом BMP LDN193189, а также экспрессией белков Glued-DN или Dad, которые подавляют сигнальную активность Mad. Искусственное повышение пресинаптической экспрессии Ube3a в нейронах C4da вызывало массированную преждевременную элиминацию сформировавшихся синапсов и общее уменьшение синаптической передачи у личинок третьего возраста. Это происходило из-за чрезмерного подавления сигнального пути BMP. Таким образом, дефекты убиквитинлигазы Ube3a, лежащие в основе синдрома Ангельмана, приводят к избыточной активности сигнального пути BMP, вследствие чего не происходит устранение ненужных синапсов в процессе развития нервной системы. Этот сигнальный путь может послужить мишенью для разработки новых методов лечения этого синдрома, а возможно и расстройств аутического спектра, считают авторы работы. В 2020 году американские исследователи сообщили, что им удалось предотвратить развитие синдрома Ангельмана у мышей с мутацией материнской копии гена UBE3A. Для этого они с помощью системы CRISPR/Cas9 инактивировали длинную некодирующую РНК UBE3A-ATS, которая подавляет экспрессию отцовской копии UBE3A.