CRISPR натравили на РНК-вирусы в клетках человека
Ученые разработали метод борьбы с одноцепочечными РНК-вирусами с помощью системы CRISPR/Cas13. Они обнаружили, что система успешно атакует консервативные последовательности в вирусном геноме вне зависимости от его размера и организации, и применили ее против вирусов лимфоцитарного хориоменингита, везикулярного стоматита и вируса гриппа типа А. Количество вирусной РНК в клеточных культурах при этом упало в десятки раз. Исследование опубликовано в журнале Molecular Cell.
Система CRISPR/Cas9 уже неоднократно показала себя в деле редактирования ДНК разных организмов. Но помимо исправления мутаций в собственных генах организма, ее можно использовать и для борьбы с чужеродными, вирусными генами. Тем не менее, около двух третей всех вирусов, атакующих человека, состоят из одной-единственной цепи РНК, которая размножается сама по себе, без ДНК-посредника. Против такого противника CRISPR/Cas9 бессильна.
Катерина Фрейе (Catherine Freije) с коллегами из Массачусетского технологического института и Гарварда решили воспользоваться другим бактериальным ферментом — Cas13, который способен вносить разрывы в нить РНК. Свою систему ученые назвали CARVER (Cas13-assisted restriction of viral expression and readout, «Ограничение размножения и передачи информации у вирусов с помощью Cas13»).
Для начала они просканировали геномы более 350 РНК-вирусов в поисках последовательностей, на которые было бы «удобно» сесть ферменту Cas13. В геноме 95 процентов вирусов они нашли не менее 10 таких участков. Для отработки метода исследователи взяли три вируса с разной структурой генома и жизненным циклом: вирусы гриппа типа А, лимфоцитарного хориоменингита и везикулярного стоматита. Для каждого из них ученые создали набор CRISPR-РНК, которые, подобно гидовым РНК в системе CRISPR/Cas9, должны были указать «молекулярным ножницам» на мишень для разрушения.
Цикл вируса хориоменингита полностью проходит в цитоплазме, его РНК не заходит в ядро клетки. 5 из 6 тестовых CRISPR-РНК вместе с Cas13 сократили количество вирусной РНК в зараженных клетках в 2-14 раз.
Вирус гриппа типа А размножается в ядре, а считывание информации с его РНК происходит в цитоплазме. Тем не менее, метод снова оказался успешным: ученым удалось сократить его концентрацию в 7-22 раза. В случае с вирусом везикулярного стоматита количество вирусной РНК снизилось в 7-43 раза.
Исследователи сравнили эффект разных CRISPR-РНК и обнаружили, что лучше всего работают те, которые нацелены на консервативные последовательности в геноме вирусов, то есть те, которые общие у разных линий вирусов. Ученые предположили, что атака CRISPR/Cas13 может ускорить их эволюцию. Они выделили вирусную РНК из клеток, в которых работали «молекулярные ножницы», но не обнаружили накопления мутаций в этих консервативных областях.
Авторы работы считают, что их метод работает эффективно и не вызывает устойчивости у вирусов-мишеней. И несмотря на то, что технологии генетического редактирования in vivo пока только тестируются, исследователи рассчитывают, что однажды их метод может если не заменить, то работать наравне с вакцинацией, особенно в тех случаях, когда противовирусных препаратов не существует, как это часто бывает с РНК-содержащими одноцепочечными вирусами.
Раньше ученые уже использовали систему CRISPR/Cas9 для того, чтобы очистить геном от других вирусов: например, клетки человека избавили от герпесвирусов, а организм мышей — от ВИЧ. Есть и другие проекты, например, удалять вирусы из генома свиней, чтобы использовать их органы для ксенотрансплантации.
Полина Лосева
Но сработала только низкая доза
Ученые из США ввели макакам-резус белок Клото. Уровень сывороточного Клото вырос в пять раз после инъекции белка. В итоге обезьяны почти на 20 процентов лучше справились с задачей на память, и эффект не прошел даже после двух недель. Но если на мышах работали разные дозы белка, то макакам хватило 10 микрограмм на килограмм массы тела — большие дозы не улучшали память. Результаты опубликованы в Nature Aging. В конце 20 века ученые открыли белок Клото (Klotho), который назвали в честь древнегреческой богини, прядущей нить жизни. Выяснилось, что мыши с дефектным геном Klotho начинают стареть уже спустя 3–4 недели после рождения, а еще у них развивается остеопороз, атеросклероз и другие патологии, а к двум месяцам они умирают. Мыши, чрезмерно экспрессирующие Klotho, напротив, живут на 20–30 процентов дольше, а их память лучше. Еще сверхэкспрессия белка защищала мозг мышей от повреждений, связанных с болезнями Альцгеймера и Паркинсона. Люди с повышенными уровнями белка тоже живут дольше, их когнитивные способности лучше, а еще у них ниже риск развития деменции и болезни Альцгеймера. В организме синтезируется две формы белка Клото — трансмембранная и секретируемая. В крови еще циркулирует растворимая форма белка, которая получается, когда ферменты отрезают от трансмембранного белка кусок. Растворимая форма может действовать как гормон, влияя на сигналинг инсулина, фактора роста фибробластов (FGF), функцию Wnt и NMDAR. Растворимую форму Клото вводили мышам в виде инъекций, и это повышало синаптическую пластичность, улучшало познание и устойчивость нейронов к старению. Стейси Кастнер (Stacy A. Castner) из Йельской школы медицины и ее коллеги решили проверить, улучшится ли память у нечеловеческих приматов, макаков-резус (Macaca mulatta), если им подкожно ввести белок Клото. Макаки-резус, как и люди, страдают от возрастного когнитивного снижения, хотя и без значительной потери нейронов. Сначала белок Клото макак ученые ввели мышам — в дозировке 10 микрограмм белка на килограмм массы тела. В предыдущих исследованиях такая доза увеличивала синаптические и когнитивные функции мышей. Здесь спустя 4 часа у мышей улучшилась синтетическая пластичность и рабочая память, которую проверяли в У-образном лабиринте. Уровень белка Клото в сыворотке мышей после инъекции увеличился в шесть раз. Затем ученые попытались повысить уровень белка в сыворотке стареющих макак, которым было в среднем около 22 лет (что эквивалентно человеческим 65), до того же уровня. Для этого они вводили макакам разные дозы Клото: от 0,4 до 30 микрограмм на килограмм массы тела. Доза в 10 микрограмм на килограмм повысила уровень сывороточного белка в пять раз. Уровень Клото в человеческой пуповинной крови тоже примерно в пять раз выше, чем в крови взрослых, — поэтому на дозе в 10 микрограмм ученые и остановились. Обезьян учили запоминать расположение отсека с пищевым вознаграждением, и таким образом оценивали их рабочую память. Задачи с нормальной сложностью, в которых было от 4 до 7 отсеков, они выполняли успешно, но не всегда справлялись с повышенной сложностью, когда отсеков было уже от 6 до 9. Уже через четыре часа после однократной инъекции белка Клото макаки стали лучше решать задачу, особенно — ее сложный вариант. Процент правильных ответов в сложной задаче увеличился с 45 до почти 60 (P = 0,0077). Этот эффект сохранялся спустя две недели и не зависел от пола. А вот более высокие дозы — 20 и 30 микрограмм на килограмм массы тела — не привели к когнитивному улучшению у макак, но и хуже не сделали. В отличие от обезьян, на мышей в предыдущих исследованиях высокие дозы белка действовали положительно. Возможно, слишком высокие дозы нарушают метаболизм у нечеловеческих приматов. Авторы предположили, что когнитивного улучшения у людей также можно будет достичь с помощью небольших, физиологических доз гормона. Также ученым еще предстоит выяснить, как сигналы белка передаются в мозг, поскольку введенный в кровь Клото сам не пересекает гематоэнцефалический барьер. Не так давно ученым удалось улучшить рабочую память людей, посветив на мозг лазером — через кожу и череп. До стимуляции люди могли запомнить 3–4 фигуры на картинке, а после — 4–5.