Исследователи из американской биотехнологической компании eGenesis клонировали поросят с модифицированным геномом, у которых инактивирован специфический эндогенный вирус свиней (PERV). Генно-модифицированных свиней компания создает, чтобы в дальнейшем использовать их как доноров органов для людей. Научная статья с описанием технологии опубликована в журнале Science, там же можно ознакомиться с заметкой с комментариями исследователей.
С каждым годом число пациентов, для лечения которых требуется пересадка органов, возрастает. При этом количество органов, доступных для пересадки, сильно ограничено, так как обычно их получают посмертно от только что погибших людей. Решить проблему доступности донорских органов могла бы ксенотрансплантация, то есть использование для пересадки органов других животных, например, обезьян или свиней. Врачам известно, что свиные органы совпадают по размеру и функциям с человеческими и хорошо подходят для трансплантации. Однако их использование в клинике пока невозможно по двум причинам — иммунная несовместимость и присутствие в клетках свиней специфического ретровируса.
Эндогенным ретровирусом свиней (PERV — Porcine Endogenous Retrovirus) заражены практически все известные породы домашних свиней. По-видимому, он появился в эволюционной истории свиней еще до одомашнивания, и даже сыграл роль в приобретении некоторых признаков, таких как интенсивность жироотложения.
Особенностью жизненного цикла ретровирусов является стадия интеграции в геном хозяина. Если вирус длительно присутствует в организме, следы его пребывания накапливаются в ДНК. При этом увеличивается как количество неактивных «обломков» генома, так и количество копий активного вируса.
В клинике не было зарегистрировано случаев передачи вируса от свиньи к человеку, несмотря на то, что свиные клетки поджелудочной железы уже использовали для трансплантации людям. Тем не менее, при совместном культивировании свиных и человеческих клеток заражение происходит. В том числе, это показали в своей работе авторы обсуждаемой статьи в Science. Ученые обнаружили, что PERV поражает клетки почек человека, продуцирует там РНК, и количество его копий в геноме увеличивается. Такие зараженные клетки могут, в свою очередь, передавать вирус здоровым клеткам. Таким образом, при использовании крупных свиных органов, таких как сердце и печень, инфекция не исключена. Поэтому условием использования свиных клеток в человеческом теле является инактивация PERV.
«Выключить» ген в клетках с использованием современных технологий генной инженерии не представляет труда, однако большой помехой для инактивации ретровируса является его многокопийность. В 2015 году команде под руководством Джорджа Черча — одного из изобретателей редактирования генома при помощи технологии CRISPR/Cas9 — удалось одновременно выключить в клетках свиней сразу 62 копии вируса. Для того, чтобы «сломать» ретровирус, ученые с использованием Cas9 направленно вносили двуцепочечный разрыв в ген, кодирующий обратную транскриптазу вируса, без которой он неактивен.
В новой работе исследователи тем же способом редактировали клетки соединительной ткани свиньи, чтобы потом использовать ядра этих клеток для пересадки в яйцеклетку (технология, стандартно используемая для клонирования животных). В клетках оказалось 25 копий ретровируса. После нескольких раундов редактирования оказалось, что нужный ген удалось выключить только в трети клеток. По-видимому, накопление большого количества двуцепочечных разрывов запускало программу клеточного самоубийства (апоптоз), что существенно снижало конечную эффективность редактирования. Чтобы избежать самоубийства редактируемых клеток, ученым пришлось проводить эксперимент в присутствии ингибиторов апоптоза. После этого эффективность редактирования достигла 100 процентов. Таким образом, авторам удалось выключить в клетках все 25 копий вируса.
Отключение апоптоза при наличии в клетках большого количества двуцепочечных разрывов может привести к хромосомным перестройкам. Действительно, авторы работы наблюдали такой эффект в большинстве полученных «безвирусных» клеточных линий. Однако при помощи анализа хромосом и выборочного секвенирования некоторых участков генома, удалось отобрать клеточную линию, в которой редактирование не привело к перестройкам или ненужным мутациям. Ядра этих клеток были использованы для пересадки в яйцеклетки и клонирования.
В результате на свет появились 37 поросят, из которых впоследствии выжило 15. Многочисленные проверки, включающие в себя анализ ДНК и РНК животных показал, что вирус в них полностью неактивен. На момент публикации статьи самому старшему поросенку исполнилось четыре месяца, и он не обнаруживал никаких отклонений в развитии.
Несмотря на то, что ученым удалось успешно избавиться от свиного ретровируса, для того, чтобы использовать свиней в качестве доноров, предстоит решить проблему иммунной несовместимости человека и свиньи. Дело в том, что свиные клетки содержат на поверхности другой набор белков и полисахаридов, нежели человеческие, поэтому ожидаемо вызывают против себя иммунный ответ. Однако представители eGenesis, сооснователем которой является Джордж Черч, утверждают, что работают над этой проблемой и собираются решить ее также при помощи генной инженерии свиней.
Компания eGenesis была основана в 2015 году. Ее целью является создание доноров органов, пригодных для пересадки людям.
Пока что трансплантацию свиных органов отрабатывают на обезьянах. К примеру, ранее мы писали, что павиан со свиным сердцем прожил почти три года.
Дарья Спасская
Ученые впервые вызвали партеногенез геномным редактированием
Генетики из американских и британских университетов обнаружили, какие гены отвечают за факультативный партеногенез у дрозофил. Они внесли точечные изменения в мушиные гены, влияющие на текучесть мембран (Desat2), образование центриолей (Polo) и скорость пролиферации (Myc). Мухи-самки из созданной генетической линии успешно вступали в половое размножение, но были при этом способны к партеногенезу как минимум на протяжении двух поколений. Исследование опубликовано в журнале Current Biology. Партеногенез — развитие живых организмов из неоплодотворенной яйцеклетки — широко распространен среди животных. На филогенетическом древе чисто партеногенетические виды нередко соседствуют с практикующими «обычное» половое размножение. Иногда и вовсе удается описать спорадические случаи появления партеногенеза у отдельных представителей непартеногенетических видов. Следовательно, генетическая подоплека партеногенеза может возникать быстро по эволюционным меркам и должна быть в этом случае относительно несложной. Но конкретные молекулярные механизмы партеногенеза часто остаются нерасшифрованными. У мух, неспособных к партеногенезу, яйцо приостанавливается на стадии метафазы I мейоза, а дальнейшее развитие (завершение деления, отделение полярных телец и дальнейшие митотические деления) продолжается лишь после оплодотворения. Но встречаются и факультативно партеногенетические линии, в которых партеногенетические потомки составляют от десятых долей до десяти процентов популяции. Доктор Алексис Сперлинг (Alexis L. Sperling) из Кембриджского Университета с коллегами из американских университетов Мемфиса и Калифорнийского технологического исследовала механизм возникновения факультативного партеногенеза у мух вида Drosophila mercatorum. Генетики отобрали и секвенировали геномы и транскриптомы факультативно и облигатно партеногенетических штаммов D. mercatorum и сопоставили их между собой. При партеногенезе была изменена экспрессия 44 генов, связанных в основном с формированием центриолей и регуляцией клеточного цикла. Несмотря на то, что предки D. mercatorum и более изученной D. melanogaster разошлись более 40 миллионов лет назад, данные сравнительной геномики позволяют воссоздавать на более известном модельном объекте изменения, обнаруженные в геноме менее известного. Ученые воссоздали у D. melanogaster выявленные изменения активности генов, прибегая к CRISPR-редактированию генома, дупликациям генов, введению в геном генов антисмысловых РНК или энхансерных последовательностей. Самый высокий уровень партеногенеза был зарегистрирован в группах трансгенных D. melanogaster, у которых была повышена активность генов Polo (регулятор образования центриолей) или Myc (регулятор клеточного цикла), либо понижена активность генов Slmb (убиквитиновая лигаза, способствующая деградации Myc) и Desat2 (фермент, синтезирующий ненасыщенные жирные кислоты и регулирующий текучесть мембран). У каждого третьего облигатно партеногенетического яйца D. mercatorum полярные тельца или женские пронуклеусы вступали в митотические деления, давая начало эмбрионам (такая же картина наблюдалась в каждом восьмом случае факультативно партеногенетических линий). Количество полярных телец, способных спонтанно вступать в митоз (и тем самым формировать эмбрион) повышалось при повышении активности генов Myc и Polo. При этом многие мухи из партеногенетических линий после целлюляризации становятся недиплоидными (чаще всего, триплоидными) из-за нарушения образования веретена деления. Ученые получили 21 тысячу мух-самок D. melanogaster, гомозиготных по мутантным аллелям генов Polo, Myc и Desat2, и содержали их в отсутствии самцов. В общей сложности самки дали 143 взрослых потомка (в среднем 0,7 потомка на 100 мух), а у тех, в свою очередь, появилось два партеногенетических взрослых потомка второго поколения (1,4 процента от численности предыдущего поколения). Таким образом, линия животных, способных к партеногенезу на протяжении нескольких поколений, была впервые получена при помощи геномного редактирования. На основании полученных данных авторы предполагают следующий механизм факультативного партеногенеза. Повышение текучести мембран (цитоплазматической и мембраны эндоплазматического ретикулума) влияет на формирование центра организации микротрубочек и, следовательно, веретена деления. Его образование упрощает вступление в митоз. Такие изменения могли стать эволюционно выгодным приобретением при расселении мух в более холодные регионы (повышение текучести мембран, связанное со снижением активности десатураз, улучшает выживаемость мух при низких температурах). Впрочем, детали возникновения партеногенетических линий мух пока не до конца изучены — судя по диспропорции между небольшими изменениями в геноме и выраженным транскриптомным изменениями, часть изменений у партеногенетических D. mercatorum может носить эпигенетический характер (важность эпигенома для партеногенеза ранее была показана в эксперименте на мышах). О медийной шумихе вокруг возможности партеногенеза у человека и о генетических предпосылках к нему читайте в нашем материале «Половинка себя».