Ученые с помощью CRISPR/Cas9 воспроизвели в геноме дрозофилы мутации, характерные для бабочек-монархов: отредактированные мухи смогли выжить в присутствии уабаина — аналога токсина из растения ваточник, которым питаются монархи. Кроме того, внося мутации по отдельности и в разных комбинациях, исследователи смогли воспроизвести последовательность, в которой приспособления к токсину появлялись в ходе эволюции. Работа опубликована в журнале Nature.
Ваточник (Asclepias curassavica) ядовит как для большинства насекомых, так и для человека. Его клетки содержат смесь сердечных гликозидов — токсинов, которые угнетают деятельность натрий-калиевой аденозинтрифосфатазы (Na/K-АТФазы) на поверхности клеток. Под их действием натрий перестает выводиться из клеток, в том числе мышечных, у них изменяется мембранный потенциал (то есть соотношение зарядов вне и внутри клетки) и они становятся более возбудимыми. Передозировка этих токсинов приводит к избыточной активности кардиомиоцитов и фибрилляции желудочков, за счет чего они и получили свое название.
Тем не менее, некоторые насекомые научились жить на ваточнике и других гликозид-содержащих растениях, причем сделали это, судя по всему, независимо. Среди таких насекомых — бабочки-монархи. Известно, что у них аминокислотная последовательность АТФазы отличается в трех местах (аминокислоты 111, 119 и 122) от обычного фермента, чувствительного к сердечным гликозидам. Однако до сих пор не было известно, единственное ли это приспособление монархов к питанию ваточником, и в какой последовательности эти мутации возникли.
Марианти Карагеорги (Marianthi Karageorgi) из Университета Калифорнии и ученые из Франции, Германии и США проанализировали последовательности Na/K-АТФазы у разных насекомых, устойчивых к гликозидам, и обнаружили, что во всех случаях мутации возникли в определенном порядке: 111-я аминокислота изменялась одной из первых, а 119-я изменялась до или одновременно с 122-й.
Ученые попробовали воспроизвести ход эволюции с помощью системы генетического редактирования CRISPR/Cas9. В качестве объекта они выбрали дрозофилу фруктовую (Drosophila melanogaster), поскольку один из ее родственников — Drosophila subobscura — также устойчив к гликозидам, а следовательно, ничто не должно мешать этой дрозофиле приобрести такую же адаптацию.
Исследователи создали набор генетически отредактированных мушек с разными вариантами мутаций, которые должны были отражать процесс эволюции АТФазы у бабочек-монархов: QAN — исходная последовательность, LAN — замена 111-й аминокислоты, LSN — две мутации: 111 и 119, VSN — еще одна мутация в 111-й и 119-й, VSH — «мушки-монархи», несут мутации в 111, 119 и 122, аналогичные белку монархов. Параллельно ученые создали мушек, у которых мутации были только в 119-й аминокислоте (QSN) и только в 122-й (QAH), чтобы проверить, что сами по себе вторая и третья мутация не дают животным преимущества.
Все варианты мушек во взрослой и личиночной стадиях проверили на выживаемость в среде с уабаином — самым известным сердечным гликозидом, который используют для блокады АТФазы в нейрофизиологических исследованиях. Оказалось, что каждая мутация немного увеличивает шанс личинок выжить. А вот взрослые особи все выживали примерно одинаково, кроме тех, кто содержал мутацию в 122-й аминокислоте. Так ученые обнаружили, что третье, последнее изменение — самое существенное.
Затем исследователи подсчитали, насколько хорошо мутантные АТФ-азы в отдельности сопротивляются действию блокатора. Они обнаружили, что каждая мутация делает белок менее чувствительным к уабаину: первая — несущественно, вторая увеличила количество активных в присутствии яда ферментов в десять раз, а третья — в тысячу раз. При этом ферменты с тремя мутациями, которые ученые получили в эксперименте у мушек, работали так же активно, как и ферменты бабочек-монархов. Из этого авторы работы сделали вывод, что трех мутаций достаточно, чтобы обеспечить устойчивость к яду, и другие физиологические приспособления к нему не обязательны.
Остался необъясненным еще один факт: третья мутация, которая наиболее существенно «улучшает» белок, почему-то появилась в эволюции последней, и только после или вместе со второй. Исследователи предположили, что в одиночку она могла как-то нарушать работу фермента, и поэтому потребовалась вторая мутация в качестве компенсации.
Поэтому они проверили мушек на судорожную активность — известно, что она повышена у тех мутантов, у кого АТФаза работает хуже. Мушек встряхивали, а затем замеряли время, которое они оставались неподвижными из-за судорог. Оказалось, что животные QAH, которые несли только третью мутацию, гораздо дольше восстанавливались после встряхивания, чем другие мухи. Это подтвердило предположение исследователей о том, что сама по себе третья мутация несет не только преимущества, но и риски: этот феномен еще называют антагонистической плейотропией.
Таким образом, с помощью генетического редактирования ученые смогли подтвердить роль мутаций в развитии устойчивости к сердечным гликозидам и провести мух по всему пути адаптации к ним. Они отмечают, что это первый в своем роде эксперимент, в ходе которого удалось воспроизвести многоступенчатый процесс адаптации с помощью генетических методов.
Биологи часто используют CRISPR/Cas9, чтобы привнести в организм определенные свойства или, наоборот, их выключить. Например, отдельным группам исследователей удалось подарить телятам устойчивость к туберкулезу, сделать ящерицу альбиносом, лишить муравьев социальной активности, а комаров — аппетита.
Полина Лосева