Редактирование генома позволило создать ящериц-альбиносов
Ученые отредактировали ДНК незрелых неоплодотворенных яйцеклеток коричневых анолисов (Anolis sagrei) с помощью CRISPR/Cas9, сообщается в Cell Reports. В результате появились ящерицы-альбиносы, которые стали первыми рептилиями с отредактированным геномом. Раньше их не удавалось получить, поскольку редактируют только что оплодотворенные яйцеклетки, а анолисы и ряд других пресмыкающихся хранят сперму самцов в яйцеводах долгое время, поэтому время слияния гамет сложно предсказать. Препринт статьи в конце марта выложили на сервер biorxiv.org, тогда же о нем писал Science, однако данные прошли рецензирование только сейчас.
Редактирование генома с помощью CRISPR в последние годы используется повсеместно, и его эффективность растет. Если в 2015 году китайские ученые смогли внести желаемые изменения лишь в четыре из 86 нежизнеспособных человеческих зигот (4,7 процента), то в 2019 году верно отредактировать удалось уже до 93 процентов клеток в зависимости от конкретной части тела — правда, на этот раз у пчел.
Изменение последовательности нуклеотидов в ДНК у млекопитающих с помощью этого метода уже практически стало рутиной. CRISPR/Cas9 вводят в оплодотворенные яйцеклетки (зиготы), чтобы отредактировать и материнские, и отцовские копии целевого гена. Однако у рептилий дело обстоит сложнее. У ящериц сперма после копуляции долгое время находится в яйцеводах, но оплодотворения при этом не происходит. Поэтому предугадать, когда нужно вводить CRISPR-систему, трудно.
Исследователи из Университета Джорджии во главе с Дугласом Менке (Douglas B. Menke) попробовали редактировать неоплодотворенные незрелые яйцеклетки коричневых анолисов (Anolis sagrei). В теории, если CRISPR/Cas9 ввести в такие ооциты, система изменит последовательность нуклеотидов только в материнских копиях целевого гена — ведь отцовских там еще нет. Тем не менее, изменения в таком случае можно было бы выявить секвенированием ДНК или электрофорезом в полиакриламидном геле.
Именно так ученые и поступили: через надрезы в стенках брюшной полости они получили доступ к яичникам 21 самки коричневого анолиса и ввели белки системы CRISPR/Cas9 суммарно в 146 незрелых яйцеклеток, чей размер не превышал 5 миллиметров (инъекция в более крупные ооциты могла бы разорвать их). После инъекции CRISPR/Cas9 и восстановительного периода самкам дали возможность контактировать с самцами, чтобы те оплодотворили отредактированные ооциты.
Мишенью системы редактирования был ген tyr, который отвечает за окраску ящериц — исследователи планировали вывести его из строя. Животные, у которых обе копии tyr нерабочие, не имеют пигмента в коже и радужках, то есть они — альбиносы. Анолисы, как и млекопитающие, имеют область в сетчатке, которая особенно чувствительна к отсутствию ряда пигментов и при альбинизме не работает как надо, поэтому анолисы-альбиносы плохо видят, и это можно выявить поведенческими тестами.
Электрофорез в полиакриламидном геле и секвенирование гена tyr у потомства показали, что всего 9 ящериц несут мутации в этом гене, которые нарушают его работу. У пяти животных делеции (выпадения участков) обнаружили только в одной из двух копий tyr — по всей видимости, материнской. Однако еще у четырех ящериц изменены были обе копии. Эти анолисы были альбиносами и плохо видели. Такие результаты показывают, что CRISPR/Cas9 долго сохраняет способность редактировать ДНК. У четырех анолисов-альбиносов система «дождалась» появления отцовских копий tyr и изменила их.
Хотя эффективность редактирования оставляет желать лучшего — в данном исследовании она составила чуть более шести процентов (9 из 146), исследователи довольны и таким результатом. Ведущий автор, Дуглас Менке, отмечает: «Никто до нас еще не смог успешно провести подобные манипуляции на рептилиях. Сообщество специалистов по генетике развития рептилий невелико, так что мы надеемся внедриться в эту интересную и малоисследованную область и успешно работать в ней».
Коричневых анолисов выбрали в качестве объекта исследования из-за строения их сетчатки. Как было сказано выше, в ней есть область, которая особенно страдает от недостатка пигмента. В этом смысле данные ящерицы похожи на людей, так что получая анолисов-альбиносов, учёные надеются лучше понять причины ухудшения зрения у людей-альбиносов.
Спектр применения системы CRISPR/Cas непрерывно расширяется. На днях появилось сообщение, что сотрудники Массачусетского технологического института и Гарвардского университета применили ее для управления гидрогелем, частицы которого находятся в сети из нитей ДНК. Разрезая эти сети, CRISPR давала возможность шарикам гидрогеля двигаться — а вместе с ними перемещались и их грузы. Такой ДНК-гидрогель можно будет использовать для адресной доставки лекарств или даже целых клеток к конкретным органам и тканям.
Светлана Ястребова
Причина оказалась в реакции на воспаление
Неврологи из Национального института здоровья США описали патогенез синдрома хронической усталости у пациентки, болевшей раком молочной железы и волчанкой. У нее обнаружили повышенную активность белка WASF3, мешающего сборке и скоординированной работе электрон-транспортной цепи митохондрий. Гиперактивация WASF3 возникла в ответ на системное воспаление, в результате снизилась эффективность тканевого дыхания, а вместе с ней и переносимость физической нагрузки. Наблюдение опубликовано в журнале Proceedings of the National academy of sciences. Центральное место в возникновении миалгического энцефаломиелита-синдрома хронической усталости занимает ответ организма на воспаление. Часто синдром связан с повышением уровня провоспалительных цитокинов, а проявления включают не только слабость и повышенную утомляемость, но и такие физические симптомы и молекулярные проявления, как снижение аэробных возможностей организма и изменение липидного обмена лимфоцитов. Патогенез синдрома пока не расшифрован до конца: лишь часть случаев синдрома хронической усталости удается объяснить последствием инфекций, а популяционно-генетические исследования плохо справляются с объяснением, почему у одних людей возникает синдром хронической усталости или похожий по проявлениям синдром поствирусной усталости, а у других — нет. Неврологи из Американского национального института здоровья под руководством Пола Хвана (Paul M. Hwang) обнаружили еще один механизм возникновения синдрома хронической усталости, обследуя пациентку с синдромом Ли-Фраумени. Это наследственное заболевание вызвано мутацией в антионкогене TP53 и проявляется злокачественными опухолями начиная с молодого возраста. У 38-летней женщины, перенесшей две опухоли молочной железы и болеющей системной красной волчанкой, с 16 лет регулярно возникали боли в мышцах ног после неинтенсивных физических нагрузок, а обследование у неврологов и ревматологов не позволило обнаружить причину симптомов. Пациентка была направлена в центр, занимающийся изучением митохондриальных заболеваний — ведь митохондриальные дисфункции часто сопровождаются мышечными симптомами, а белок p53 влияет напрямую на митохондрии. Ученые обнаружили, что у пациентки примерно в два раза снижена скорость восстановления мышечных запасов креатинфосфата и активность IV комплекса дыхательной цепи митохондрий. Причем снижены не только в сравнении со здоровыми людьми, но и в сравнении с родным братом пациентки, носителем той же мутации в TP53, не болевшим опухолями или аутоиммунными заболеваниями. В мышечных клетках у сестры было больше активной (фосфорилированной) формы белка p53, чем у брата, а причиной тому, как выяснили ученые, является повышенная активность белка WASF3. Функции этого внутриклеточного белка касаются ремоделирования цитоскелета и регуляции синтеза АТФ в митохондриях, но через цепочку посредников белок влияет и на активность p53. Ученые создали несколько линий мышей с гиперактивированным или выключенным WASF3 и выяснили, что WASF3 нарушает организацию III и IV комплексов электрон-транспортной цепи митохондрий на мембране и ускоряет деградацию IV (цитохром с-оксидазного) комплекса. Эффективность работы дыхательной цепи максимальна, когда два комплекса находятся в непосредственной близости друг от друга в соотношении 2:1, а нарушение пропорции снижает КПД клеточного дыхания. Мыши с несколькими копиями WASF3 показывали более низкие результаты в беговых упражнениях. У пациентки же повышение активности WASF3 было связано с посттрансляционными модификациями белка, но не имело геномной подоплеки и не сопровождалось изменениями транскриптома клеток. Нарушения энергетического обмена в клетках иммунной и нервной системы при синдроме хронической усталости были известны и раньше, но находка американских врачей подчеркивает, что данные отдельно геномики или протеомики не всегда эффективны в расшифровки патогенеза болезней, в которых тесно переплетены геномные факторы и ответ на действие внешней среды. Изучению патогенеза синдрома хронической усталости во многом поспособствовал постковидный синдром, имеющий похожие звенья патогенеза и клиническую картину. Но мы рассказывали и о других факторах, ухудшающих работу мышц — в частности, о том, как прием антигистаминных препаратов снижает тренируемость.