CRISPR приспособили для управления гидрогелем
Способность популярной технологии редактирования генома CRISPR/Cas разрезать нити ДНК использовали для контроля над перемещениями шариков гидрогеля, которые находились в сети из молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты. При изменении конфигурации сетей, вызванном действием CRISPR, менялось и положение шариков. В будущем CRISPR-управляемые гидрогели можно будет использовать для прицельного высвобождения лекарств и удаленного запуска различных других процессов, говорится в статье, опубликованной в Science.
Белки Cas и короткие палиндромные повторы в ДНК, с которыми эти белки связываются, впервые обнаружили у бактерий в 1987 году, а вскорости их открыли и у архей. Выяснилось, что Cas способны разрезать одно- и двухцепочечные молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты в определенных местах. Это взяли на вооружение американские и французские биологи во главе с Дженнифер Дудной и попробовали сами назначать CRISPR/Cas мишени для создания разрывов в ДНК. Технологию дорабатывали, испытывали в клетках прокариот и разнообразных эукариот: грибов, животных, растений. Теперь с помощью CRISPR/Cas можно редактировать и РНК, а для конкретной цели подбирают свой белок Cas (впрочем, чаще всего это Cas9).
Джеймс Коллинс (James Collins) и его коллеги из Массачусетского технологического института и Гарвардского университета пошли дальше и применили способность CRISPR/Cas разрезать молекулы нуклеиновых кислот для работы неживых систем. Они ввели систему с белком Cas12a в ДНК-гидрогель — систему полимерных шариков, образующих в воде коллоидный раствор и разделенных нитями ДНК. Между этими нитями образовывались одноцепочечные мостики, и задача CRISPR/Cas заключалась в том, чтобы разрезать их.
Разрезание одноцепочечной ДНК меняло структуру гидрогеля: уцелевшие двухцепочечные нити смещались и сеть, которая держит шарики, распадалась, после чего они могли свободно перемещаться. Контролируемое изменение свойств гидрогеля можно использовать для адресной доставки различных молекул и клеток: высвобождать их там, где это необходимо, в нужный момент. В одной серии экспериментов ДНК-гидрогель и CRISPR/Cas поместили в микрофлюидную камеру. Когда через эту камеру проходил генетический золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus), устойчивый к метициллину, или вирус лихорадки Эбола, это «замечал» белок Cas12a, состояние гидрогеля менялось и система тем самым подавала сигнал о присутствии чужеродной ДНК.
Исследователи тестировали несколько видов гидрогеля с разными частицами: из полиакриламида, полиэтиленгликоля и технического углерода. Какие-то из них больше подходят для применения в биоэлектронике, так как проводят электричество, какие-то — для высвобождения лекарств, поскольку способны разлагаться. Также вместо полимеров можно использовать живые клетки.
Дэн Луо (Dan Luo), биоинженер из Корнелльского университета, который не принимал участия в исследовании, отмечает, что раньше ДНК-гидрогелями не получалось управлять с помощью ферментов: они либо разрезали слишком мало молекул, либо производили надрезы в незапланированных местах. Поэтому создание системы с использованием CRISPR/Cas в данном случае — значительный шаг вперед.
CRISPR уже не первый раз пробуют соединять с различными специализированными материалами. Если в нынешнем исследовании предлагается использовать систему для доставки лекарств, клеток, наночастиц и тому подобного, то годом ранее ее саму транспортировали в желаемые органы — головной мозг и печень — с помощью наночастиц из золота и оксида железа соответственно.
Светлана Ястребова
Впрочем, лишь на 4-6 дней
Европейские микробиологи обнаружили у почвенной бактерии Bacillus subtilis способность к хранению информации о смене дня и ночи. Если содержать бактерий в условиях 24-часовых суток, то у них устанавливался суточный цикл экспрессии ytvA — белка, чувствительного к синему свету. После смены режима освещения перестройка экспрессии ytvA происходила не мгновенно: признаки предыдущего цикла «день-ночь» сохранялись еще 4-6 дней. Чем ярче был свет днем, тем короче становился период колебаний экспрессии ytvA после перехода с режима «день-ночь» на полную темноту — так же ведут себя и некоторые циркадные ритмы человека. Исследование опубликовано в журнале Science Advances. Наиболее хорошо изучены циркадные ритмы, регулирующие поведение, рост и развитие эукариот. Но похожие внутриклеточные сигнальные пути описаны и у фотосинтетических прокариот, для метаболизма которых освещенность критически важна. Более того — в последние годы следы похожих систем находят в геномах и протеомах архей и бактерий, неспособных к фотосинтезу. Пока неизвестно, как устроены и для чего нужны такие системы прокариотам, неспособным к фотосинтезу. Марта Мерров (Martha Merrow) с коллегами-микробиологами из университетов Дании, Нидерландов, Великобритании и Германии описали циркадный ритм, связанный с регуляцией ответа на стресс у сапрофитной почвенной бактерии Bacillus subtilis. У бактерии есть несколько разновидностей фоточувствительных пигментов, от которых сигнал через цепочку посредников сходится на белках семейства Rsb. Они влияют на экспрессию более 200 генов, опосредующих ответ на осмотический, температурный, окислительный стресс и на действие антибиотиков. Основной пигмент, отвечающий за детекцию синего света у B. subtilis — белок ytvA. Ученые получили два штамма «дикого типа» B. subtilis и модифицировали их таким образом, чтобы бактерии синтезировали люциферазу вместе с белком ytvA (таким образом, клетки флуоресцируют прямо пропорционально уровню экспрессии ytvA). На первом этапе микробиологи в течение пяти суток растили культуры бактерий в условиях двенадцатичасового дня (монохроматический синий свет с длиной волны 450 нанометров) и двенадцатичасовой ночи (полная темнота). После того, как бактерии «привыкали» к такому режиму, их на неделю оставляли в темноте. Как и ожидали ученые, в первой фазе эксперимента активность ytvA падала спустя полчаса после включения синего света и плавно нарастала в темное время суток. Но во второй фазе колебания не исчезли, а их период растянулся до 29,4-30,2 часов, в зависимости от штамма. У культур B. subtilis, выросших без света, тоже были обнаружены колебания экспрессии ytvA с периодом 26-31 дня. Затем ученые решили посмотреть, как меняется активность ytvA при изменении продолжительности цикла «день-ночь». Как и в первой части экспериментов, сначала бактерии росли в условиях двенадцатичасовых периодов света и темноты. Но через пять дней ученые сокращали цикл в два или три раза. Поначалу после смены режима у бактерий сохранялся 24-часовой паттерн экспрессии ytvA, а рост активности гена в ответ на дополнительные периоды тьмы был менее выраженным. Но уже спустя пять дней бактерии «переучивались» на новый режим света и тьмы. Во время эксперимента ученые обнаружили у бактерий эффект, описанный в хронобиологии как «правило Ашоффа»: чем больше интенсивность освещения днем, тем короче становятся циркадные циклы в темноте у дневных организмов. При росте освещенности с 0,1 до 60 микроэйнштейнов на квадратный метр в секунду период колебаний падал в среднем с 27,5 ± 1,9 до 24,1 ± 0,7 часа. Ранее правило Ашоффа было описано в экспериментах на птицах и арабидопсисе, но не у прокариот. Открытие микробиологов показывает: сложно устроенные и зарегулированные циркадные ритмы распространены шире, чем считалось ранее. Впрочем, пока неизвестны белки, управляющие экспрессией фоточувствительного ytvA, и неясно, какие эволюционные преимущества дает бактериям такая регуляция. Авторы предполагают, что фоторецепторы, активирующие ответ на стресс, могут быть нужны почвенным организмам для регуляции для снижения интенсивности метаболизма на большой глубине. Подробнее о циркадных ритмах у представителей разных царств живой природы читайте в нашем материале «Ход часов лишь однозвучный», а о роли синего света в их регуляции — в материале «Только синь сосет глаза».