Магнитные наночастицы доставили CRISPR точно в опухоль
Американские биоинженеры разработали подход для адресной доставки компонентов системы редактирования генома при помощи магнита. Для этого ДНК, кодирующую компоненты системы CRISPR-Cas9, упаковали в вирусные частицы насекомых с покрытием из наночастиц оксида железа. Такие частицы можно «включать» в ткани при помощи направленного магнитного поля, а «выключаются» они с участием иммунитета хозяина. При помощи магнитной доставки CRISPR авторам удалось локально сломать ген в опухоли у мышей. Работа опубликована в Nature Biomedical Engineering.
Любой терапевтический подход, требующий локального присутствия лекарства в конкретном органе в организме животного сталкивается с проблемой адресной доставки. Если терапевтический агент представляет собой ДНК, эту проблему решает, например, использование в качестве «почтальонов» адено-ассоциированных вирусных векторов, которые в зависимости от серотипа имеют сродство к разным тканям и доставляют ДНК в клетки. Тем не менее, такие векторы имеют ограничения по размеру «посылки», к тому же так как они сконструированы на основе вирусов млекопитающих, их поведение в организме не всегда предсказуемо.
Исследователи из университета Райса предложили отправлять ДНК-содержащие частицы по адресу при помощи магнитного поля, предварительно покрывая их наночастицами оксида железа. При этом в качестве средства доставки исследователи выбрали векторы на основе вирусов насекомых (бакуловирусные векторы). Они не способны реплицироваться в организме млекопитающих, тем не менее легко проникают во многие типы клеток и обеспечивают там временную экспрессию ДНК-посылки. Правда, вводить их раньше имело смысл только локально в ткани, потому что при системной доставке (например, через кровь) бакуловирусные частицы инактивируются системой комплемента в сыворотке.
Авторы работы обнаружили, что покрытые оксидом железа вирусные частицы в присутствии магнитного поля эффективно проникают в клетки, невзирая на систему комплемента. Таким образом, в отсутствии поля частицы неактивны, а под действием магнита начинают работать и отправлять ДНК в клетки.
В эксперименте на мышах ученые доставляли ДНК, кодирующую систему редактирования генома CRISPR-Cas9, «заряженную» против гена Vegfr2, кодирующего рецептор фактора роста эндотелия сосудов. Сначала магнитные бакуловирусные частицы с «посылкой» вкалывали мышам в подкожную опухоль, где под действием магнита ДНК эффективно экспрессировалась, и CRISPR инактивировал нужный ген. Затем исследователи проверили эффективность редактирования при системной доставке и показали, что если частицы вводить внутривенно, они в итоге оказываются в «намагниченном» месте (печени либо опухоли) и позволяют сломать там ген со средней эффективностью в несколько процентов (в расчете на целый орган). Хотя это не очень много, такой подход помог бы избежать токсичности системы, связанной с нецелевым редактированием в организме и длительным присутствием чужеродной ДНК.
Ранее мы рассказывали, что другая исследовательская группа разработала на основе золотых наночастиц систему
. Уже готовые компоненты системы редактирования – белок Cas9 и направляющую РНК – пришивали к золотым наночастицам, которые затем вводили в мозг мышам. Такой подход, в частности, помог снизить избыточную экспрессию глутаматного рецептора в мозге и
.
Дарья Спасская
Он оказался высокоактивным лигандом рецептора иммунных клеток
Японские и нидерландские ученые обнаружили в клеточной стенке микобактерии лепры (Mycobacterium leprae) фенольный гликолипид-III (PGL-III), который ответственен за запуск иммунного ответа в зараженном организме. Как сообщается в статье, опубликованной в журнале ACS Central Science, инициация иммунохимических реакций происходит за счет активации кальций-зависимого рецептора лектина (Mincle-рецептор), для которого PGL-III выступает крайне активным лигандом. Микобактерия лепры при попадании в организм человека может вызывать проказу, которая в основном поражает кожу, периферические нервы и глаза. В 2021 году зарегистрировано более 140 тысяч новых случаев проказы, в том числе от нее пострадали более девяти тысяч детей. Хотя проказу можно вылечить с помощью комплексной лекарственной терапии, она до сих пор приводит к инвалидизации и неизгладимым обезображиваниям людей в странах Африки и Азии. Считается, что тяжелые поражения моторной функции при проказе вызваны специфическим воспалением, однако его патогенез до сих пор плохо изучен. Важным антигеном, который отвечает за иммуногенность микобактерии лепры, считается фенольный гликолипид-I (PGL-I), который составляет до двух процентов массы бактериальных клеток. При этом PGL-I обладает мощным иммуносупрессивным действием, из-за которого M. leprae способна вызывать хроническую инфекцию. Однако окончательная роль подобных антигенов в развитии симптомов проказы изучена плохо. Чтобы исправить это положение, команда ученых под руководством Йерун Коде (Jeroen Codée) из Лейденского университета и Шо Ямасаки (Sho Yamasaki) из Университета Осаки исследовали потенциальные иммуноактивные компоненты в гликолипидной клеточной стенке M. leprae. Сначала ученые обнаружили, что липиды клеточной стенки микобактерии лепры активируют клетки миелоидного происхождения (макрофаги, нейтрофилы) с помощью кальций-зависимого рецептора лектина (Mincle-рецептор). По такому же пути их активировали липиды клеточной стенки M. tuberculosis и M. smegmatis. Затем ученые разделили липидные экстракты с помощью высокоэффективной тонкослойной хроматографии, чтобы охарактеризовать наиболее иммуноактивный компонент. Фракционирование с использованием разных комбинаций растворителей выявило липид, избирательно активирующий клеток, экспрессирующие Mincle-рецепторы. Как выяснилось с помощью матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (MALDI-TOF-MS) этот липид крайне похож на PGL-I, однако в нем отсутствует одна метильная группа в углеводной части. Поскольку в процессе биосинтеза PGL-I образуется несколько промежуточных продуктов, подобных PGL-I, ученые решили проанализировать этот путь, чтобы выяснить природу этого липида. После введения различных генов в экспериментальные модели M. marinum, ученые выделили несколько промежуточных продуктов биосинтеза PGL-I, среди которых выделялись PGL-II, так и PGL-III, которые были описаны ранее. Методом органического синтеза ученые создали чистые образцы PGL-I, II и III, чтобы проверить их активность взаимодействия с Mincle-рецептором. С помощью спектроскопия ядерного магнитного резонанса ученые выяснили, что тем самым липидом, специфически активно связывающимся с Mincle-рецептором и через него активирующим клетки иммунной системы был PGL-III. Это неожиданное открытие, поскольку ранее сообщалось о том, что лигандами этих рецепторов могут быть только моно- и дисахариды концы гликолипидов, однако PGL-III имеет трисахаридный углеводный конец. Дальнейшие анализы показали, что синтетический PGL-III проявлял намного бОльшую, чем PGL-I и -II, лигандную активность в отношении Mincle-рецепторов мыши и человека. Учитывая его низкую концентрацию и относительную активность, удельная активность PGL-III, по-видимому, достаточно высока. Синтетический PGL-III активировал первичные макрофаги с помощью Mincle-рецепторов, после чего они начинали вырабатывать провоспалительные цитокины фактор некроза опухоли и интерлейкин-6. Кроме того, PGL-III индуцировал экспрессию NO-синтазы. То есть PGL-III микобактерии лепры выступает мощным иммуностимулирующим агентом, запускающим высвобождение провоспалительных цитокинов, будучи высокоактивным лигандом Mincle-рецепторов. В эксперименте с мышами с нокдауном генов, ответственных за экспрессию Mincle-рецепторов, заражение их микобактерией лепры приводило у них к значительной бактериальной нагрузке, что говорит о решающей роли Mincle-рецепторов в индукции иммунных реакций при проказе. Ученые считают, что метилтрансфераза, которая ответственна за метилирование PGL-III, может стать терапевтической мишенью при лечении проказы, поскольку ее ингибирование должно приводить к накоплению PGL-III и большему иммунному ответу организма. При этом будет снижаться концентрация PGL-I, которая провоцирует воспаление и считается фактором вирулентности. Считается, что проказа — болезнь человека. Однако в 2021 году зоологи описали случай проказы у диких шимпанзе. При этом с высокой вероятностью они заработали болезнь от мелких млекопитающих, а не от человека.