Модифицированная CRISPR/Cas9 снабдила телят устойчивостью к туберкулезу

Китайские ученые вывели коров с повышенной устойчивостью к туберкулезу, применив модифицированный метод редактирования генома CRISPR/Cas9. Посвященная работе публикация появилась в журнале Genome Biology.

Система CRISPR/Cas9 обнаружена в геноме прокариот, где она играет роль естественной защиты от вирусов и выполняет ряд других функций. На основе этой системы разработана технология высокоточного редактирования генома эукариот, позволяющая выключать или встраивать гены в четко заданном участке ДНК. Ограничивают применение этой технологии побочные (off-target) модификации генома. Они возникают из-за того, что при двухцепочечном разрыве ДНК нуклеазой Cas9 репарация происходит преимущественно путем негомологичного соединения концов, что часто приводит к возникновению небольших мутаций по типу инсерций-делеций и хромосомных перестроек.

Чтобы снизить риск подобных нежелательных эффектов, сотрудники Северо-западного университета сельского и лесного хозяйства в Янлине провели иммунопреципитацию хроматина с секвенированием (исследование, позволяющее определить место связывания определенного белка с ДНК), чтобы выявить участки связывания мутантной формы Cas9, лишенной ферментной активности, с геномом фибробластов коровьих плодов. Среди этих участков ученые выбрали те, где ожидаемые побочные эффекты редактирования ДНК минимальны.

Затем в выбранные участки встроили ген NRAMP1, обеспечивающий естественную устойчивость к туберкулезу, с помощью модифицированной системы CRISPR/Cas9n, которая основана на никазе Cas9, разрывающей только одну цепочку ДНК. При таком подходе репарация со вставкой заданного гена происходит путем гомологичной рекомбинации, которая значительно лучше защищена от ошибок, чем негомологичное соединение концов.

После этого ядра наилучших трансгенных фибробластов перенесли в коровьи яйцеклетки с предварительно удаленными ядрами. Из получившихся яйцеклеток с двойным набором хромосом вырастили эмбрионы, которые перенесли для вынашивания в матку животных. В итоге они получили девять трансгенных телят с помощью CRISPR/Cas9n и двоих — с помощью природной CRISPR/Cas9 в качестве контроля.

У всех животных ген встроился в заданный участок ДНК и экспрессировался макрофагами различных органов и тканей. При этом в экспериментальной группе существенных побочных эффектов не наблюдалось, а в контрольной они присутствовали у обоих животных. Кроме того, частота развития и вынашивания беременности при переносе эмбрионов, полученных методом CRISPR/Cas9n, оказалась выше, чем при использовании «классической» методики.

Эксперименты по заражению трансгенных животных и культур выделенных у них макрофагов возбудителем коровьего туберкулеза Mycobacterium bovis показали, что NRAMP1 обеспечивает более интенсивный иммунный ответ и подавляет рост микобактерий по сравнению с обычными животными и их иммунными клетками, то есть повышает естественную устойчивость к инфекции.

«Наша работа впервые продемонстрировала, что систему CRISPR/Cas9n можно использовать для создания трансгенного скота без определяемых побочных эффектов. В ходе нее мы также обнаружили оптимальный участок коровьего генома для вставки новых полезных для сельского хозяйства генов с помощью этой технологии», — заключил ведущий автор работы Юн Чжан (Yong Zhang).

Число успешных экспериментов по применению CRISPR/Cas9 и ее модификаций растет с каждым месяцем. В качестве примера можно привести работы по лечению серповидноклеточной анемии и других гемоглобинопатий, мышечной дистрофии, буллезного эпидермолиза и пигментного ретинита. Используется эта технология и для генной модификации сельскохозяйственных культур: так, в США фактически разрешена продажа полученных с ее помощью шампиньонов, которые не темнеют на воздухе. О популярности CRISPR/Cas9 свидетельствуют и планы по созданию сериала, действие которого разворачивается вокруг этой технологии — его продюсером должна стать Дженнифер Лопес.

Олег Лищук